钩芍降压颗粒对自发性高血压大鼠血管紧张素Ⅱ及肾动脉钙敏感受体的影响*

赵文博 李心亮 奚剑敏 蔡增博 唐雅琳 祖攀宁 唐沛兰 赵瑞成△

（1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；2.湖南省中医药研究院中药药理毒理实验室，湖南 长沙 410013；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

张崇泉教授为湖南省中医药研究院附属医院资深专家、老年病和心血管病学术带头人，主任医师，享受政府特殊津贴专家，第3批及第4批全国名老中医药专家学术经验传承工作指导老师［1］。通信作者赵瑞成主任医师为张崇泉教授第4批学术经验继承人，带领研究生团队参加“张崇泉名老中医药专家传承工作室”工作，重点整理与研究张崇泉教授治疗心脑血管病经验［2-4］。钩芍降压颗粒为张崇泉教授经验方，上世纪90年代，经临床研究验证，钩芍降压颗粒具有缓慢持久的降压效果［5］，能改善左心室舒张功能［6］。近年来，临床研究与实验观察，发现钩芍降压颗粒可以改善缺血性中风神经功能缺损［7］，通过保护血管内膜，具有抗动脉硬化作用［8］，但其作用机制不清楚。本文就钩芍降压颗粒的降压机制进行如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SHR大鼠30只，体质量174～253 g；雄性 Wistar大鼠 10只，体质量 186～220 g，均 6周龄，由湖南省中医药研究院中药药理毒理实验室购自上海斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：2015000518364。大鼠饲养在湖南省中医药研究院实验动物中心，正常饮食，室温20～25℃，适量通风，适应环境1周。

1.2 试药与仪器 1）钩芍降压颗粒组成：钩藤30 g，白芍 20 g，地龙 10 g，生地黄 20 g，葛根 15 g，川牛膝10 g，泽泻10 g。全部为中药免煎颗粒，由四川新绿色药业科技发展股份有限公司生产。2）厄贝沙坦片，进口药品，注册证号H20140006，进口药品分类批准文号：国药准字 J20130049，规格 150 mg/片。2）仪器：PB1502电子天平、BP-6无创血压计、台式高速冷冻离心机（湘仪H1650R）、全自动酶标洗板机（汇松PW-812）、多功能酶标分析仪（汇松MB-530）、恒温培养箱（光明 DHP-500）、自动平衡离心机（湘仪 L530）。

1.3 分组及给药 30只SHR大鼠，依据给药前血压随机分为模型对照组、阳性对照组及实验组，每组10只，另雄性Wistar大鼠10只作为空白对照组。依据体质量灌胃给药，阳性对照组予厄贝沙坦（厄贝沙坦150 mg溶于192 mL蒸馏水，每只大鼠每次灌胃4 mL），实验组予钩芍降压颗粒（钩芍降压颗粒溶于200 mL蒸馏水，每只大鼠每次灌胃4 mL）、模型对照组与空白对照组予等量蒸馏水。每日1次，连续4周。

1.4 标本采集与检测 1）采用无创血压计测量大鼠动脉收缩压，灌胃前和灌胃2、4周后，各测1次。2）末次给药后，将大鼠禁食不禁水24 h，称质量，10%水合氯醛麻醉，肝素钠抗凝管，腹主动脉取血4 mL，3000 r/mim离心5 min后取上清液。各种试剂移至室温（18～25℃）平衡至少30 min。分别设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37℃温育2 h。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，置37℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，置37℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光显色15 min。依序每孔加终止液50 μL，终止反应。在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。3）大鼠处死，钝性分离肾动脉，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，脱蜡和水化后，PBS洗两次各5 min。用于甲醛固定石蜡包埋组织切片。水浴锅加热0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液至95℃，放入组织切片加热15 min，加热完毕用自来水冷却至室温，取出。PBS洗5 min。滴加封闭液，室温5 min。滴加一抗，4℃过夜，PBS洗3次每次2 min。滴加羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育1 h。PBS洗3次每次2 min。DAB显色，苏木素复染20 s，蒸馏水洗2次每次2 min。脱水后放入100%二甲苯10 min透明。拍照分析钙敏感受体（CaSR）表达。每张切片随机抓取400倍的视野，根据细胞核染色为蓝色，统计视野中总细胞数，根据CaSR阳性信号染色统计阳性细胞数。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量数据均以（±s）表示，资料满足正态分布及方差齐性，组间比较采用成组t检验，组内比较采用配对t检验。计数资料采用χ2分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血压比较 见表1。空白对照组组内比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型对照组组内比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组组内比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；实验组组内比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。组间比较，模型对照组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠血压比较（mmHg，±s）

与本组实验前比较，*P＜0.05；与空白对照组同时期比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n 灌胃4周后实验前 灌胃2周后空白对照组 10 122.00±4.90模型对照组 10 190.00±4.60*阳性对照组 10 125.00±2.80 121.00±6.31 122.00±5.22 160.00±4.20 173.00±3.62 162.00±4.90 123.00±3.32实验组 10 144.00±2.50*162.00±6.60 162.00±6.94

2.2 各组血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量测定 见表2。灌胃4周，酶联免疫吸附法测定血清中AngⅡ含量，模型对照组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组与空白对照组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；实验组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组血清AngⅡ含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组血清AngⅡ含量比较（pg/mL，±s）

组 别 n AngⅡ空白对照组 10模型对照组 10阳性对照组 10 7.46±2.69 18.15±1.83*11.81±3.75*实验组 1010.13±3.53

2.3 各组肾动脉CaSR表达比较 见表3，图1。灌胃4周，免疫组化法检测肾动脉CaSR免疫组化表达（见表3）。模型对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组与空白对照组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；实验组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组肾动脉CaSR表达比较（n，%）

图1 各组肾动脉CaSR表达（免疫组化染色，400倍）

3 讨 论

高血压发病机制中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在调节水盐代谢维持血容量与血管张力以及调控心血管、肾脏功能等方面起着极其重要的作用。本课题实验研究证实，实验组血清AngⅡ含量与空白对照组相当，低于模型对照组，与阳性对照组比较差异无统计学意义，提示钩芍降压颗粒可以降低血清AngⅡ含量。

CaSR是G蛋白偶联受体（GPCRs）C家族的成员，其在神经系统、心血管系统、胃肠道、肾脏及骨组织中有广泛的分布，当与激动剂及变构调节剂结合后，激活下游相关信号通路，对于机体钙离子（Ca2+）稳态的维持具有重要调节作用［9］。1993年，Brown等首次在牛甲状旁腺中克隆出细胞外CaSR，并证实细胞外钙（［Ca2+］o）发挥着第一信使的作用［10］。 增加［Ca2+］o 可通过膜的稳定效应而导致血管的松弛，其机制与钙敏感受体（CaSR）有关［11］。 Ca2+是细胞内最普遍、最重要的信号转导成分，而且在细胞内外维持一定的浓度差。细胞内钙离子（［Ca2+］i） 浓度的升高主要通过胞内Ca2+释放和［Ca2+］o 内流两大途径，而［Ca2+］o 内流在传递细胞信息方面更为重要。血管内皮细胞持续Ca2+内流能释放舒张因子一氧化氮（NO）以维持血管内环境稳定。激活CaSR 可引起［Ca2+］i升高及 NO 生成［12］。 本研究证实，钩芍降压颗粒可以增强SHR大鼠肾动脉CaSR表达。

Smajilovic等在1篇综述中对CaSR在血压调节中发挥重要生理作用进行了归纳总结，［Ca2+］o激活CaSR而产生降血压作用的可能机制是通过抑制肾脏肾素-血管紧张素系统的激活［13］。之后，又有学者对拟钙剂降低血压的机制进行了研究，认为甲状旁腺中的CaSR激活后，可抑制肾素的分泌，进而降低血管紧张素Ⅱ和醛固酮的水平，使血压降低机制占主导作用［14］。尽管，CaSR在肾素-血管紧张素系统作用没有完全阐明，但CaSR对血压的调节作用是肯定的，随着研究的深入，CaSR更多的作用机制将被揭示。

钩芍降压颗粒由钩藤、生白芍、生地黄、葛根、干地龙、丹参、川牛膝、泽泻组成，方中钩藤清热平肝，息风解痉；生白芍养血柔肝，敛阴抑阳为君药；生地黄、葛根养阴舒筋；干地龙、丹参、川牛膝活血通络，泽泻引经归肾，利尿降浊［6］。诸药共奏滋阴平肝、活血通络之效。在高血压发病机制中“肾动脉痉挛狭窄”可引起的肾素血管紧张素系统活性增加。钩芍降压颗粒组方原则立足滋阴平肝，活血通络，而现代医学“肾动脉痉挛狭窄”类似于中医“络脉拙急”，故钩芍降压颗粒的作用契合“肾动脉痉挛狭窄”病机。

本研究证实，钩芍降压颗粒可以降低自发性高血压大鼠血清AngⅡ含量，为其降压机制之一。同时活化肾动脉CaSR，尽管CaSR在高血压发病机制研究尚不深入，但与AngⅡ作用相关是肯定的，例如，已有研究证实CaSR参与了AngⅡ诱导大鼠心肌H9c2细胞肥大［15］。钩芍降压颗粒可能通过活化肾动脉 CaSR缓解“肾动脉痉挛”而降低了AngⅡ含量，但需进一步研究证实。

（鸣谢：感谢张崇泉教授提供科研处方及在课题设计中给予的指导！）

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