骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠的构建

刘远志 周吉银 张祚 李和教 黄毅岚

1西南医科大学药学院（四川泸州 646000）；2陆军军医大学第二附属医院国家药物临床试验机构（重庆 400037）；3西南医科大学附属医院药学部（四川泸州 646000）

Neuritin（又名：Nrn1或CPG15）是在研究可塑性相关基因时被发现的一种神经营养因子，具有促进轴突、树突生长和皮层神经细胞的存活、抑制神经细胞凋亡、调节神经细胞回路形成等作用，对受损神经有着明显修复的功效［1-2］。目前，随着糖尿病的病患率急剧上升，在糖尿病诊断5年后其外周神经病变的发病率大于50%；且在糖尿病周围神经病变后期，患者会发生糖尿病足等严重并发症。研究表明当糖尿病发生后，骨髓神经受损情况对糖尿病周围神经病变密切相关，但是具体作用机制尚不十分清楚，需进一步研究［3］。因此，建立骨髓特异性高表达neuritin小鼠模型，可作为研究neuritin对骨髓神经损伤修复作用的良好平台，将为进一步研究骨髓神经病变与糖尿病周围神经病变提供基础。本研究使用CMV-Loxp-STOPLoxp系统高表达neuritin转基因小鼠和骨髓特异性Lyz2-Cre转基因小鼠进行繁殖、交配，筛选出骨髓特异性高表达neuritin的转基因小鼠作为动物模型，并对模型鼠进行骨髓鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验动物委托广州赛业生物科技有限公司构建CMV-loxp-stop-loxp系统高表达neuritin（loxpstop-loxp-neuritin）转基因小鼠，骨髓特异性Lyz2-Cre小鼠购至美国杰克逊实验室。小鼠在陆军军医大学第二附属医院SPF级动物室饲养和繁殖。

1.2 主要器材与试剂器材：PCR扩增仪（美国Bio-Rad）；DYCP-31D型电泳槽（北京六一仪器厂）；恒温金属浴（杭州博日公司）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad CFX96 Touch）；小型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；双光速微量核酸蛋白测定仪（美国Thermo公司）；凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司）；激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）。试剂：PCR引物（北京擎科生物技术有限公司），序列均由美国Jackson实验室提供；蛋白酶K（美国Sigma公司）；2×Taq Mix（北京天根公司）；DNAmarker（上海生工生物技术工程有限公司）；琼脂糖（Invitrogen公司）；溴化乙锭（EB）（美国Sigma公司）；鼠抗Nueritun单抗（Santa Cruz公司）；Alexa Fluor®647羊抗鼠二抗（碧云天公司）；封闭用正常山羊血（武汉博士德生物技术有限公司）；TritonX-100（上海生工生物技术工程有限公司）。其他常用试剂均属于国产或进口的分析纯试剂。

1.3 小鼠的饲养和繁殖采用CMV-loxp-stop-loxp系统得到的全身高表达neuritin（Loxp基因）转基因小鼠（F0），与骨髓特异性Lyz-cre小鼠进行杂交，获取表达两种基因型（Loxp基因、Lyz-Cre基因）的阳性小鼠（F1），即骨髓特异性高表达neuritin的转基因小鼠。

1.4 小鼠的基因型鉴定

1.4.1 小鼠DNA的提取用酒精擦拭待测小鼠鼠尾后，剪取尾尖约0.5～1 cm的组织，置于1.5 mL的Eppendorf（EP）管中，操作参照DNA提取试剂盒（北京天根生物），进行基因组DNA的提取，以双光速微量核酸蛋白测定仪测定浓度后，置于-20℃保存。

1.4.2 Neuritin基因的鉴定使用neuritin引物扩增鼠尾基因组DNA，鉴定其是否含有loxp位点。Loxp 位点引物：Loxp-F：5′-TCCCCATCAAGCTGATCCGG-3′，Loxp-R：5′-TCACACTTGCCC-GCTGCTCT-3′；Actin 内参引物：Actin-F：5′-ACTCCAAGGCACT-TATCACCAT-3′，Actin-R：5′-AT-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′。PCR 条件：（1）94 ℃预变性3 min，（2）94℃变性30 s，（3）62℃退火35 s，（4）72 ℃延伸35 s，（5）94 ℃变性30 s，（6）60 ℃退火35 s，（7）72 ℃延伸35 s，（8）最后72℃延伸3 min；（2）～（4）重复10个循环（每个循环退火温度降低0.5℃），（5）～（7）重复25个循环。以1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，含有loxp位点的neuritin基因扩增产物具有234 bp阳性条带和413 bp内参条带，而野生型neuritin基因扩增产物只含有413 bp内参条带。

1.4.3 Lyz-cre重组酶转基因的鉴定使用Lyz-cre重组酶基因扩增鼠尾基因组DNA，鉴定其是否含有Lyz-cre重组酶基因。Lyz-cre引物：Lyz-Cre-Mutant：5′-CCCAGAAATGC-CAGA-TTACG-3′，Lyz-Cre-Common：5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′，Lyz-Cre-Wild type：5′-TTACA-GTCGGCCAGGCTGAC-3′。PCR 条件：（1）94 ℃预变性3 min，（2）94 ℃变性30 s，（3）65 ℃退火15 s，（4）68 ℃延伸10 s，（5）94 ℃变性15 s，（6）60 ℃退火 15 s，（7）72 ℃延伸10 s，（8）最后72 ℃延伸2 min；（2）～（4）重复10个循环（每个循环退火温度降低0.5℃），（5）～（7）重复25个循环。以1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，含有Lyz-Cre基因扩增产物的杂合子具有700 bp、350 bp阳性条带，而野生型突变基因小鼠只含有350 bp条带。

1.4.4 组织免疫荧光检测小鼠骨髓neuritin的表达（1）取组织：用4%的多聚甲醛对实验小鼠进行灌注固定，分离股骨；（2）组织固定与脱钙：将取得的股骨用4%的多聚甲醛淹没放于4℃冰箱固定过夜，于第二日将股骨取出放于10%EDTA脱钙1周；（3）组织切片：首先在样品托上涂一层OCT包埋胶，将脱钙后的股骨置于其上，4℃冰箱预冷5～10 min让OCT胶浸透组织，然后在其上再添一层OCT胶，置于速冻架上30 min；修片，切片：股骨切片厚度8 μm，切片室温放置晾干后，用0.01 mol/L PBS液浸泡3遍，每遍5 min；（4）封闭：将切片放于封闭液（含0.3%Triton X-100和5%BSA）中孵育30 min；（5）孵育一抗：倾去血清，加入一抗：鼠抗Nueritun单抗1∶100，4℃孵育过夜；阴性对照用PBS代替；（6）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（7）Alexa Fluor®647（1∶400）二抗，37 ℃避光孵育1 h；（8）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（9）复染核：滴加DAPI，避光孵育13 min；（10）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（11）用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片并在荧光显微镜下拍照。

1.5 统计学方法实验结果用SPSS 17.0软件进行分析，数据以均数±标准差表示，两用独立样本的t检验；多组组间对比采用Two-way ANOVA（双尾方差分析），以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠繁殖情况亲代loxp-stop-loxp-neuritin与转基因小鼠lyz-Cre/+交配，产生的F1代小鼠经PCR鉴定共有4种基因型，即neuritinloxp/+_lyz-Cre/+、neuritinloxp/-_lyz-Cre/+、neuritinloxp/+_lyz-Cre/-、neuritinloxp/-_lyz-Cre/-；各占约 25%。neuritinloxp/+_lyz-Cre/+即为骨髓特异性高表达neuritin小鼠。以上繁殖结果遵循孟德尔遗传定律。

2.2 小鼠基因鉴定亲代loxp-stop-loxp-neuritin与lyz-Cre/+杂交后产生的F1代通过2组特异性引物对其DNA进行鉴定，PCR鉴定F1代小鼠基因型的部分结果如图1。编号6、8、9、10、12小鼠经loxp引物扩增后表现出2条413 bp和234 bp扩增条带，为 neuritinloxp/+；编号 7、11、13小鼠表现出 1条234 bp扩增条带，为neuritinloxp/-；编号 7、8、9、11小鼠经Cre引物扩增后表现出2条700 bp和350 bp的扩增条带，为Lyz-Cre/+，编号6、10、12、13小鼠表现出1条350 bp扩增条带，为Lyz-Cre/-。结果显示13号小鼠的基因型为neuritinloxp/-_lyz-Cre/-，为野生型小鼠；6、10、12号小鼠的基因型为neuritinloxp/+_lyz-Cre/-，为杂合子小鼠；7、11号小鼠的基因型为neuritinloxp/-_lyz-Cre/+，为杂合子小鼠；8、9号小鼠的基因型为neuritinloxp/+_lyz-Cre/+，即为骨髓特异性高表达neuritin小鼠（图1）。

图1 基因型鉴定PCR产物电泳图Fig.1 PCR genotyping results of the genotype of transgenic mice

2.3 组织免疫荧光检测neuritin的表达量共聚焦显微镜观察8周龄neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠与野生型小鼠骨髓neuritin表达量，进一步验证neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓中是否高表达neuritin。结果如图2所示，通过Image J 1.50软件分析，与野生型小鼠相比，neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin表达量明显增加（P＜0.05），结果证实PCR方法鉴定neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠可靠（图3）。

图2 免疫荧光技术显示骨髓neuritin的表达Fig.2 Photomicrographs showing the immunofluorescence expression of neuritin in bone marrow

图3 neuritin在野生型和高表达小鼠骨髓中的表达量比较Fig.3 A comparison of the neuritin expression level of the neuritinloxp/+_lyz-Cre/+mice and the wild type mic mice

3 讨论

本研究构建的模型鼠采用的是Loxp-Cre转基因重组酶系统，其包含Cre重组酶和loxp序列。Cre重组酶能特异性的识别loxp序列，使反向loxp序列间的DNA被颠倒，同向loxp序列间的DNA被切除，实现基因特异性敲除［4］。在骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠中，于启动子和靶基因序列之间插入了一段“loxp-stop-loxp”结构，即把构建的“启动子-loxp-stop-loxp-neuritin”结构导入小鼠中，使小鼠全身细胞均含有neuritin的高表达基因，而此时靶基因的表达处于抑制状态（此过程由广州赛业生物科技有限公司完成）［5］。将该鼠与Lyz-Cre酶转基因小鼠（美国杰克逊实验室构建）杂交，若其杂交后代的基因型中有既含Lyz-Cre基因又含“启动子-loxp-stop-loxp-neuritin”的基因，则Lyz-Cre基因会表达骨髓细胞特异性Cre重组酶，催化骨髓细胞loxp间的序列位点进行特异性重组，最终将“stop”转录终止结构从基因序列中切除，使小鼠骨髓的neuritin高表达基因得以表达。此外，将不同特性的Cre酶转基因小鼠与“启动子-loxp-stop-loxp-靶基因”的转基因小鼠杂交，可实现靶基因不同部位的表达［6-7］。

因此，为确定小鼠骨髓高表达neuritin蛋白，需验证杂交后代鼠同时具有Lyz-Cre基因和“启动子-loxp-stop-loxp-neuritin”基因，本课题组采用DNA的PCR鉴定判断其基因型。此外，由于转基因小鼠全身基因组DNA均兼有loxp和Lyz-Cre酶基因，因此对小鼠基因型鉴定时可采用小鼠尾组织DNA提取物［8］。研究结果显示，两种转基因小鼠通过杂交可将各自的基因位点遗传给后代，且可并存在于一个后代鼠中，获取我们所需的骨髓特异性高表达neuritin模型鼠（图1）。同时，利用组织免疫荧光对其骨髓的neuritin蛋白的表达量进行半定量分析，结果表明neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin蛋白表达量明显高于野生型小鼠（P＜0.05），差异有统计学意义，证明小鼠模型构建成功。

本研究构建的骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠，其骨髓会高表达neuritin蛋白，当小鼠骨髓神经受损后，neuritin作为神经营养因子，对受损神经具有显著的修复作用。骨髓发生神经病变可严重影响骨髓中干细胞的功能，如造血干细胞和间充质干细胞［9-10］。造血干细胞主要源于是各种血细胞与免疫细胞的初始细胞，统领着全身造血功能；间充质干细胞是骨髓中的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有强大的分化性和自我更新能力，能归巢到损伤组织发挥修复作用［11-12］。而骨髓神经病变后，神经末梢的数量会急剧减少，骨髓交感神经通过骨髓细胞上β-肾上腺素能受体调控造血干细胞、成骨细胞和骨髓间充质干细胞释放入血；骨髓自主神经数量减少也可降低骨髓雪旺细胞数量并快速造成骨髓造血干细胞丢失［13-14］。因此，骨髓神经病变是骨髓功能障碍的一个关键因素，而骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠可作为研究外周神经病变修复的模型鼠，如糖尿病外周神经病变。

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