沉默lncRNA PVT1对鼻咽癌细胞C666-1增殖、侵袭转移的影响

万仁强 林勇 肖平 龚平桂

1广东省第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科（广州510317）；2喀什地区第一人民医院耳鼻咽喉科（新疆喀什844000）

长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸，不具有蛋白质编码功能的RNA分子。研究表明lncRNA与基因表达、胚胎发育、物质代谢等有着密切的联系，因此被称为基因组学的富矿。近年来大量研究［1-2］表明lncRNA在多种疾病中扮演了重要的角色，并且作为调节因子通过多种途径参与细胞增殖、分化、凋亡、药物抵抗、上皮间质转化等［3-6］。

变异性浆细胞瘤异位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是最近被发现的一种特异性的lncRNA，全长1 716 bp，位于人类染色体8q24，原癌基因MYC下游，其转录产物属于基因间的lncRNA［7］。近年来研究［8-11］表明，PVT1 在多种肿瘤中高表达，例如肝癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等，并且与预后相关。然而，目前国内外关于PVT1在鼻咽癌中的研究还比较少，因此本研究通过检测PVT1在鼻咽癌细胞中的表达，利用siRNA干扰技术研究降低PVT1后对鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭的影响，为进一步研究PVT1在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制提供初步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株鼻咽癌细胞5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1、HONE-1及鼻咽永生化上皮细胞NP69购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂RNA提取试剂盒Rneasy MiNi Kit购自美国Qiagen公司；逆转录试剂盒iScript cDNA synthesis kit购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTM购自TakaRa公司；Keratinocyte-SFM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝（MTT）购自上海碧云天公司；Traswell小室、细胞培养瓶、细胞培养板购自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人鼻咽永生化上皮细胞NP69接种于含10%胎牛血清的新鲜Keratinocyte-SFM中培养。人鼻咽癌细胞5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1及HONE-1接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养基加青霉素与链霉素，两抗生素最终浓度分别为100 U/L及100 mg/L，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 荧光定量PCR检测PVT1的表达按照RNA提取试剂盒提取鼻咽癌细胞及NP69细胞中总RNA，测定浓度，-80℃保存。采用SYBR Green法检测PVT1的相对表达，反应条件：95℃15 min，95℃30 s，60℃60 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min。siPVT1 F：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；R：5′-UAGCAGCAACGGAGAAGCTT-3′；siNC F：5′-UUCUCCGAACGUGUGUCACGUTT-3′；R：ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；PVT1 上游引物5′-GTCTTGGTGCTCTGTGTTC-3′，下游引物5′-CCCGTTATTCTGTCCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物 5′-GCTGATGATCTYGAGGCTGTGTTGTC-3′。

1.2.3 细胞转染及RT-PCR检测运用LipfectamineTM2000转染试剂盒转染siPVT1及对照siRNA，分别于24及48 h后收集细胞，提取总RNA并逆转录为cDNA，RT-PCR检测PVT1的表达。PVT1干扰RNA（siPVT1）及阴性对照（siNC）序列由吉玛公司合成提供；siPVT1上游序列：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCATT-3′，下游序列：5′-UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3′；siNC上游序列：5′-GCUACGAUCUGCCCAAGAUTT-3′，下游序列：5′-AUCUUAGGCAFGAUCGUCGCTT-3′。

1.2.4 MTT比色实验将对数期生长的siPVT1/C666-1细胞按1×103个/孔接种至96孔板内，重复5孔。常规培养24、48、72 h后，弃培养基，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL），继续培养 4 h后，加入150 μL DMSO溶解，酶标仪570 nm处检测各孔OD值，取平均值绘制细胞增殖曲线。

1.2.5 Transwell细胞迁移与侵袭实验将细胞制成单细胞悬液并用无血清培养基漂洗3遍，细胞计数。在Boyden小室上室加入（或不加）200 μL稀释的Matrigel胶，过夜干燥。在Transwell小室上室接种1× 105个细胞（200 μL），在小室的下室加入300 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为趋化因子。37℃、5%CO2培养箱培养24 h，取出小室，PBS浸泡洗涤2次。95%乙醇浸泡固定Transwell上室穿膜细胞，PBS洗涤2次，以新鲜配制的苏木素染液，浸染3～5 min，然后用棉签擦除上室中未通过滤膜的细胞，显微镜下观察拍照、计数。

1.2.6 Western blot检测EMT标记物的表达转染后24 h收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质，转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、β-actin抗体1∶2 000稀释）4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗（抗兔1∶3 000稀释）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，暗室加入ECL发光液后曝光显影。

1.3 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差表示，采用两样本t检验统计学方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PVT1在人鼻咽癌细胞中的表达实时定量PCR检测PVT1在鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、5-8F、C666-1、HNE-1、6-10B及HONE-1中的表达。结果显示，与NP69细胞相比，PVT1在鼻咽癌细胞中表达上调，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 转染siPVT1后PVT1的表达实时定量PCR结果显示，C666-1细胞转染siPVT1后PVT1的相对表达量显著降低，见图2。

2.3 细胞增殖率检测MTT结果显示，转染siPVT1 24 h后实验组细胞的OD值为（0.34±0.05），对照组细胞的OD值为（0.59±0.06），经两独立样本t检验差异具有统计学意义（P＜0.05）。转染48、72 h后，实验组细胞的OD值分别为（0.53± 0.04）、（1.15± 0.12），对照组细胞的OD值为（0.90±0.09）、（1.67±0.13），差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图1 PVT1在人鼻咽癌细胞中的表达Fig.1 Expression of PVT1 in human nasopharyngeal carcinoma cells

图2 转染siPVT1后C666-1细胞中PVT1的表达Fig.2 Expression of PVT1 in C666-1 cells after transfection of siPVT1

图3 siPVT1能抑制鼻咽癌细胞生长Fig.3 SiPVT1 can inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma cells

2.4 下调PVT1对C666-1迁移、侵袭能力的影响Transwell迁移实验显示（图4A），siPVT1组细胞穿膜数为（54±6.3）个，siNC组的细胞穿膜数为（110±8.9）个，差异具有统计学意义（P＜0.05）。侵袭实验（图4B）结果示：siPVT1组细胞穿膜数为（41±5.8）个，siNC组的细胞穿膜数为（72±7.3）个，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明下调PVT1后可抑制鼻咽癌细胞C666-1的迁移及侵袭。

2.5 下调PVT1对鼻咽癌细胞EMT的影响荧光定量RT-PCR和Western blot结果显示，下调PVT1可升高鼻咽癌细胞E-cadherin的表达，降低N-cadherin和Vimentin的表达，见图5。

3 讨论

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤，其分布具有明显的地域性和种族性。放疗是治疗鼻咽癌的主要方法，目前放疗同步化疗是鼻咽癌的标准治疗方法［12］。然而经过标准治疗后仍有约20%～30%鼻咽癌患者出现局部复发或者远处转移［13］。出现远处转移后缺乏有效的治疗手段，这也是造成鼻咽癌患者死亡的最主要原因。因此，寻找鼻咽癌发病机制中的关键分子作为有效的治疗靶点，对于治疗及预防鼻咽癌细胞转移、延长患者的生存期和提高生存质量具有非常重要的意义。

lncRNA PVT1位于原癌基因MYC下游，已被证明与多种肿瘤的发生、发展密切相关，具有癌基因的作用；有报道称，MYC与PVT1一同扩增，形成“伙伴”关系，PVT1可帮助增强MYC蛋白的致癌作用［7］；另一研究［14］表明，在乳腺癌中PVT1和MYC可协同作用调控RSPO1的表达，增加乳腺癌癌变前的特性，促进癌症形成。高表达的PVT1与前列腺癌的级别相关，并且导致前列腺癌的激素抵抗［15］，降低PVT1的表达可抑制多种肿瘤细胞增殖、迁移等［16-17］。

本研究首先利用荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌细胞中PVT1的表达，检测结果显示5-8F、C666-1、CNE-1、6-10B、CNE-2、HNE-1及HONE-1等多种人鼻咽癌细胞中PVT1的表达均较对照组增高，但瘤细胞各组间也有一定的差异，考虑可能跟不同的鼻咽癌细胞生物学特性有关，如生长增殖及迁徙等能力，另外，不同组细胞经过多次不同传代培养后生物学特性发生改变，从而造成不同组人鼻咽癌细胞中PVT1的表达存在差异；然后，利用RNA干扰技术，设计合成PVT1-siRNA，将此siRNA序列与对照siRNA转染C666-1细胞，采用实时定量RT-PCR检测沉默效果，发现转染24及48 h后，PVT1表达显著下降。采用MTT法检测沉默PVT1对细胞增殖的影响，结果显示，沉默PVT1可显著抑制C666-1细胞增殖。Transwell迁移及侵袭实验显示，沉默PVT1后C666-1细胞的透膜细胞数少于阴性对照组，证实PVT1具有促进鼻咽癌细胞迁移及侵袭的能力。

图4 Transwell细胞迁移与侵袭实Fig.4 Transwell cell migration and invasion experiment

图5 下调PVT1逆转鼻咽癌细胞EMTFig.5 Down regulation of PVT1 to reverse nasopharyngeal carcinoma cell EMT

上皮间质转化（EMT）现象与肿瘤的浸润转移密切相关。在此过程中上皮细胞的极性丧失，与周围细胞和基质接触减少，迁移和运动能力增强，同时上皮表型丢失而逐渐获得间质表型。EMT的特征性改变为其上皮标志物表达量下降（如E钙黏素、角丝蛋白），而间质标志物表达量升高（如N钙黏素、波形蛋白等），同时EMT转录相关因子表达量也增加（如snail）。为研究沉默PVT1是否能抑制EMT，本研究检测了E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达，结果显示，下调PVT1可升高鼻咽癌细胞E-cadherin的表达，降低N-cadherin和Vimentin的表达，提示下调PVT1表达对鼻咽癌细胞EMT有逆转作用，研究结果与文献报道一致［17-18］。

综上所述，PVT1在鼻咽癌细胞的增殖和侵袭转移过程中起着重要的作用，提示PVT1有可能是与鼻咽癌形成和进展相关的一个重要基因，本研究的完成为鼻咽癌的治疗提供了一个新的潜在的治疗靶点。

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