蛇床子素对睡眠剥夺大鼠记忆功能的影响

杜展鑫 唐珮瑜 谢炜基 潘晓佳 罗伟聪 陈棋棋 欧超然 梁建芬 朱晓琴

1广州医科大学（广州511436），2广州医科大学基础学院机能实验中心（广州511436）

睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）是指某些原因导致的睡眠时间减少或睡眠质量下降。睡眠剥夺后机体发生氧化应激，大量产生的氧自由基和一氧化氮（NO）具有较强的神经毒性作用，可导致脑组织损害，造成记忆功能的损伤［1-4］。失眠症发病率在中国高达10%～20%，已成为重要的公共卫生问题之一。而目前临床上常用的安眠药长期服用可导致不同程度的成瘾性、耐药性与记忆损伤等。已有研究［5-6］表明蛇床子素（osthole，Ost）具有清除氧自由基、镇静催眠及促进学习和记忆的作用，因此其在失眠症的治疗具有广阔的应用前景。而Ost的抗氧化应激作用对睡眠剥夺大鼠的记忆功能的影响尚未明确，故本研究通过复制大鼠睡眠剥夺模型，探究Ost对睡眠剥夺模型大鼠学习记忆的影响及其作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与仪器Ost（南京泽朗医药科技有限公司）；BCA试剂盒（Bioworld Technology CO.，Ltd.）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化（SOD）与一氧化氮（NO）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；睡眠剥夺箱（参照文献自制）；Morris水迷宫（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 实验方法成年雄性SD大鼠48只，体质量200～230 g，随机分为4组：正常对照组（NC组）、大平台组（TC组）、睡眠剥夺模型组（M组）与Ost组（25 mg/kg），每组12只。腹腔注射给药，每天1次，连续7 d。采用改良多平台睡眠剥夺法建立大鼠SD模型［7］。将M组和Ost组大鼠置于水箱中的小平台剥夺睡眠72 h，TC组的大鼠置于水箱中的大平台，NC组大鼠单笼饲养。SD 3 d后大鼠活动增多，兴奋性明显提高，继而出现睡眠昼夜节律不明显，易激惹、嘶叫、攻击，最后呈现出精神萎靡，对外界刺激反应淡漠，进食时达到睡眠状态表明造模成功［7］。于给药第3天开始行Morris水迷宫实验进行大鼠学习记忆的训练与测试［8］。测试结束后处死大鼠，取下腔静脉血，检测血清中MDA与SOD的含量。断头取脑，取新鲜海马，检测海马MDA、SOD和NO活性。取新鲜全脑行HE染色，光镜观察海马组织CA1区神经细胞。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析进行统计分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ost对SD大鼠海马组织MDA、SOD和NO的影响与NC、TC组比较，M组海马组织的MDA和NO含量均升高（P＜0.05），SOD活力代偿性增加（P＜0.01，P＜0.05）。Ost组大鼠海马组织中MDA与SOD含量均低于M组（P＜0.05），但NO含量与M组无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠海马组织MDA、SOD和NO含量检测结果Tab.1 Results of MDA，SOD and NO content in mice hippocampus（n=12）±s

表1 各组大鼠海马组织MDA、SOD和NO含量检测结果Tab.1 Results of MDA，SOD and NO content in mice hippocampus（n=12）±s

注：与NC组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与M组比较，cP＜0.05，dP ＜ 0.01

组别NC组TC组M组Ost组MDA（nmol/mg）10.6±4.3 12.9±5.6c 26.5±9.4a 11.5±7.3d SOD（U/mg）62.8±37.3 79.9±50.5c 172.0±36.5b 82.6±25.9d NO（μmol/g）0.1±0.1 0.1±0.0c 0.7±0.3a 0.5±0.3a

2.2 Ost对SD大鼠血清MDA和SOD的影响与NC、TC两组比较，M组血清MDA含量明显增加（P＜0.05）。Ost组较M组血清MDA含量显著减少（P＜0.05）。而各组间血清SOD含量无显著性差异。见表2。

表2 各组大鼠血清MDA和SOD含量检测结果Tab.2 Results of the content of MDA，SOD and NO in mice serum（n=12）±s

表2 各组大鼠血清MDA和SOD含量检测结果Tab.2 Results of the content of MDA，SOD and NO in mice serum（n=12）±s

注：与NC组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与M组比较，cP＜0.05，dP ＜ 0.01

组别NC组TC组M组Ost组MDA（nmol/mL）20.1±3.5 15.4±7.8c 32.9±13.5a 10.1±7.0d SOD（U/mL）202.3±21.5 190.2±31.0 183.9±12.3 180.5±31.8

2.3 Ost对SD大鼠水迷宫实验的影响与NC组和TC组比较，M组逃避潜伏期显著增加而平台穿越次数显著减少（P＜0.01）。相比M组，Ost组大鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.01）而穿越平台次数增加（P＜0.05）。见表3。

2.4 Ost对海马CA1区形态学的影响CA1区锥体层神经元的形态：NC组细胞轮廓清晰，胞浆透明，与NC组比较，M组细胞排列疏松紊乱，部分神经元脱失，TC组细胞形态与其相似；与M组比较，TC组细胞排列较紧密，Ost组CA1区完整，锥体细胞数明显增多，轮廓更清晰，细胞排列稍紊乱，细胞形态基本正常。见图1。

3 讨论

睡眠是个体生存发育所必需的一项重要生理活动，而SD是研究睡眠机能的一个重要手段。研究表明，SD对认知水平有很大影响，可通过多种途径损伤海马CA1区神经元，造成学习和记忆功能减退［1-2，9］，其中氧化应激起着重要的作用［10］。睡眠剥夺后机体所处的高代谢状态导致线粒体电子链传递时自由基产生增加，当其超过抗氧化防御系统功能的上限即可引起氧化应激。研究证实，SD可诱发海马和血清氧自由基与海马NO含量增加，同时造成海马神经元的损伤，使认知能力显著下降［3-4，11］。MDA 是脂质过氧化物的分解产物，其含量间接地反映了自由基的损害程度［12］。SOD是体内天然存在的自由基清除的重要酶类，反映机体抗氧化和清除自由基的能力［13］。本研究通过检测MDA和SOD的浓度以反映机体氧化应激水平。NO对睡眠-觉醒周期起着重要的调控作用，是睡眠调节因子发挥睡眠调节作用的共同通路［14］。过量的NO具有神经毒性，通过促进氧自由基的生成和释放，诱发氧化应激，并与氧自由基相互作用，产生细胞毒性［15］。TC组旨在探讨改良多平台法中水环境等应激是否会对大鼠的学习记忆能力造成影响。

图1 大鼠海马CA1区神经细胞形态学（HE×200）Fig.1 Morphology of neuron in hippocampus CA1 of mice（HE × 200）

表3 各组大鼠Morris水迷宫实验结果Tab.3 Results of Morris maze test of mice（n=12） ±s

表3 各组大鼠Morris水迷宫实验结果Tab.3 Results of Morris maze test of mice（n=12） ±s

注: 与NC组比较，aP＜0.05，bP＜0.01; 与M组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别NC组TC组M组Ost组注:与NC组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与M组比较，cP＜0.05，dP＜0.01逃避潜伏期SD前48 h 42.2±20.0 43.7±14.2 55.7±20.7 45.2±19.0 SD前24 h 32.3±8.2 27.6±5.6 45.9±20.2 28.4±7.3 SD24 h 26.4±3.4 27.6±2.9c 35.6±15.6b 26.8±7.7d SD48 h 23.8±2.0 35.5±11.3c 44.3±20.5b 31.4±14.4d SD72 h 24.3±5.2 27.4±12.6c 27.5±2.3b 25.0±5.1d穿越平台次数11.8±2.9 9.6±4.9c 4.6±1.5b 9.5±3.9c

Ost具有抗炎、清除氧自由基、脑保护、促进学习和记忆、降低海马组织NO含量以及促进内源性神经干细胞的增殖等作用［5-6，16］；其中，Ost可在自由基链反应的各个环节阻断反应的进行，从而对抗自由基对细胞和组织的损伤。实验结果显示，M组大鼠海马组织、血清中的MDA含量，以及海马组织中的SOD活性均明显高于NC组和TC组，说明SD后动物脑内自由基明显增多，脂质过氧化程度加重，可能为机体自由基清除系统代偿性升高所致。与M组相比，Ost组海马组织与血清的MDA水平显著降低，海马组织SOD活力明显恢复，提示Ost具有抗氧化应激的作用。相较NC组与TC组，M组大鼠海马中的NO含量升高，而Ost组的NO含量与M组无显著差异，提示Ost无降低SD后NO的神经毒性作用。

行为学实验结果显示，SD 72 h可造成大鼠学习记忆的获得和维持能力的下降，同时水刺激等应激并不会对SD大鼠的学习记忆能力造成损害；而Ost可以有效减少SD所造成的学习和空间记忆功能损害。脑组织切片观察结果提示Ost可减轻SD对海马神经元所造成的损害。

综上所述，Ost可能通过降低海马组织与血清中MDA含量，恢复海马组织中SOD活性，减轻海马组织神经细胞的损害从而发挥对SD大鼠记忆功能的保护作用。其具体作用机制及影响因素仍需进一步研究。

［1］LIM J，DINGES D F.A meta-analysis of the impact of short-term sleep deprivation on cognitive variables［J］.Psychol Bull，2010，136（3）：375-389.

［2］JACKSON M L，GUNZELMANN G，Whitney P，et al.Deconstructing and reconstructing cognitive performance in sleep deprivation［J］.Sleep Med Rev，2013，17（3）：215-225.

［3］IKEDA M，IKEDA-SAGARA M，OKADA T，et al.Brain oxidation is an initial process in sleep induction［J］.Neuroscience，2005，130（4）：1029-1040.

［4］陈莉弘.睡眠剥夺影响学习记忆机制的研究进展［J］.医学研究生报，2015，28（10）：1098-1101.

［5］HUANG W C，LIAO P C，HUANG C H，et al.Osthole attenuates lipid accumulation，regulates the expression of inflammatory mediators，and increases antioxidants in FL83B cells［J］.Biomed Pharmacother，2017，91：78-87.

［6］张晓平，陈新梅，崔清华，等.蛇床子素药理作用及其相关机制研究进展［J］.中国执业药师，2013，10（11）：28-32.

［7］何玉宏，王培欢，席兰兰，等.改良多平台法建立大鼠部分睡眠剥夺模型及其效果评价［J］.实用医药杂志，2015，32（12）：1107-1111.

［8］SCHOENFELD R，SCHIFFELHOLZ T，BEYER C，et al.Variations of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation［J］.Neurobiol Learn Mem，2017，139：117-127.

［9］DUCLOS C，BEAUREGARD M P，BOTTARI C，et al.The impact of poor sleep on cognition and activities of daily living after traumatic brain injury：A review［J］.Aust Occup Ther J，2015，62（1）：2-12.

［10］SRINIVASAN P，DUR-ZONG H，FU Y H，et al.Sleep deprivation-induced multi-organ injury：role of oxidative stress and inflammation［J］.Excli J，2015，14（8）：672-683.

［11］HAVEKES R，ABEL T.The tired hippocampus：the molecular impact of sleep deprivation on hippocampal function［J］.Curr Opin Neurobiol，2017，44：13-19.

［12］NIIJIMA F，SAITO H，MURAI S，et al.Effect so fat omoxe-tine on level sofmonoamines and relted substances in discrete brain regions in mice intermittetly deprived of rapid eye movement sleep［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（4）：617-621.

［13］WEI L F，ZHANG H M，WANG S S，et al.Changes of MDA and SOD in brain tissue after secondary brain injury with seawater immersion in rats［J］.Turk Neurosurg，2016，26（3）：288-384.

［14 CHEN L，MAJDE J A，KRUEGER J M.Spontaneous sleep in mice with targeted disruptions of neuronal or inducible nitric oxide synthase genes［J］.Brain Res，2003，973（2）：214-222.

［15］ANDREY V KOZLOV，SOHEYL BAHRAMI，HEINZ REDL，et al.Alterations in nitric oxide homeostasis during traumatic brain injury［J］.BBA-Mol Basis Dis，2017，1863（10 Pt.B）：2627-2632.

［16］YUHUI YAN，LIANG KONG，YANG XIA，et al.Osthole promotes endogenous neural stem cell proliferation and improved neurological function through Notch signaling pathway in mice acute mechanical brain injury［J］.Brain Behav Immun，2017，67：118-129.