添加复合菌株快速发酵虾头制酱工艺优化

解万翠，尹 超，宋 琳，许志颖，贾俊涛，张俊逸，李钰金，连 鑫，杨锡洪※

（1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院, 青岛 266042；2. 山东出入境检验检疫局，青岛 266002；3. 青岛信和源生物科技有限公司，青岛 266002；4. 荣成泰祥食品股份有限公司，威海 264303；5. 广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，湛江 524088）

0 引 言

虾酱（shrimp paste），又名虾膏，是一种传统发酵水产调味品，味道鲜香，是常用调味料[1-2]，同时还含有丰富的蛋白质、钙、类胡萝片素和几丁质[3-4]等营养物质，具有多种生物功能活性，包括抗氧化活性[5]、降低胆固醇、降血压及增强机体免疫力等[6]。研究表明，传统发酵水产调味品基于低值鱼虾等加入食盐自然发酵，工艺生产周期长，利于形成独特的风味，吴帅等[7]总结了传统发酵调味品鱼露的风味物质的产生途径；但传统产品含盐量高、品质较难控制，制约了工业化发展[8]。在保持虾酱传统风味的同时，利用现代食品生物技术对传统工艺进行改造，提高生产效率，促进虾酱产业化发展，是目前亟待发展的方向。

降低盐含量[9]、外加酶制剂[10]以及提高发酵温度[11]等可以加快蛋白质水解速度达到快速发酵的目的，从而成为改进鱼露虾酱等调味品生产工艺的新思路。新工艺虽然提高了生产效率，但仍存在产品风味不足、产品质量不稳定等缺陷。发酵体系中复杂的微生物组成，能够随发酵进行逐渐改变原料的风味和香气[12-14]，因此接种微生物发酵剂于发酵体系中受到越来越多学者的关注，且能够使功能微生物在短时间内占据优势地位，抑制有害微生物，促进风味物质的形成，稳定产品质量，达到快速发酵的目的[15-16]。

Turchi等[17]利用植物乳杆菌和嗜热链球菌发酵驴奶，探究了单菌发酵及其2种菌协同发酵条件下制备新型发酵驴奶饮料的可能性；高玉荣等[18]优化了毛霉制曲及豆豉后发酵期间接种鲁氏接合酵母的工艺条件，为豆豉多菌种低盐发酵工艺提供参考；Bertuzzi 等[19]将腐生葡萄球菌、干酪棒状杆菌与汉逊德巴利酵母用于奶酪的发酵中，显著改变了奶酪的外观和香气；赖婷等[20]优化了利用复合乳酸菌发酵龙眼的工艺条件，最佳工艺条件∶料液比为 1∶7，发酵温度为 37℃，发酵时间为53 h，接种量为1.4 mL/100g，菌种配比为1∶1。单一菌种作为发酵剂用于虾酱发酵已有研究[15]，而将虾头作为原料利用复合发酵剂发酵制备虾头酱的研究鲜有报道。虾头包含了虾的很多器官组织，营养丰富，而长期以来虾头作为废料处理，造成浪费污染，目前市场也有虾头酱出售但制备工艺复杂[21]。本文通过接种外加复合菌株，探索快速发酵虾头酱的工艺技术；基于感官及氨基态氮分析，利用响应面分析法(RSM)对发酵过程工艺参数进行优化，旨在为快速发酵虾头酱筛选优良菌株作为复合发酵剂，达到提高生产速率、稳定生产的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：虾头，取自湛江国联水产开发股份有限公司，为南美白对虾加工副产物[21-22]。传统发酵虾酱：由李锦记(广东新会)食品有限公司提供，以低值虾为原料，采用传统方法发酵，发酵过程中未添加菌种。

季氏毕赤氏酵母（Pichia gilliermondii）[23]，黑曲霉（Aspergillus niger）[24]，均为本实验室从中国传统虾酱中筛选和鉴定出的风味优势菌，并长期保存。植物乳杆菌（Lactobacillus planticola）标准菌株，购自中国工业微生物菌种保管中心。

察氏培养基：NaNO30.2 g，K2HPO40.1 g，KCl 0.05 g，MgSO40.05 g，FeSO40.001 g，蔗糖 3.0 g，蒸馏水 100 mL，121℃灭菌20 min；虾汁培养基：将小虾打浆与水按1∶5的比例混合，过滤、分装于50 mL三角瓶中，每瓶20 mL，115 ℃灭菌 30 min。

MRS（de Man Rogosa and Sharpe）肉汤及麦芽汁培养基，BR级，购自北京陆桥技术有限责任公司，其他试剂均为分析纯，购自国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HR2648型绞碎机（菲利普电器(亚洲)有限公司）；HPX-9052MBE型恒温培养箱（博讯实业有限公司医疗设备厂温度分辩率：0.1 ℃温度波动度：±0.2℃）；AY-120型电子天平（深圳巨杰科技有限公司 最小称量0.1 mg）。

1.3 试验方法

1.3.1 感官评价方法

采用描述性定量分析(quantitative descriptive analysis，QDA)法[18,25]。感官评定小组由9人组成，在感官评定前，先进行风味品评的培训，对样品的风味特征（鲜味、虾味、咸味、发酵味、腥味、氨气味、苦涩味及整体可接受性）进行评分。评分包括0分到9分，总计10个分数，“0”代表没感受到该风味，“9”代表这种风味浓郁。评价标准见表1。

表1 风味感官评价标准Table 1 Standards of sensory evaluation on flavor

1.3.2 氨基态氮测定

采用甲醛电位滴定法，参照ZBX 66038-1987。

1.3.3 菌株的驯化

将外加的 3种菌株（季氏毕赤氏酵母、黑曲霉及植物乳杆菌标准菌株）分别接种于300 mL麦芽汁培养基、察氏培养基和MRS液体培养基中，于32或28 ℃、80 r/min摇床培养，第2天移取0.l mL菌液涂布于固体培养基中分离，测定存活菌数，而后在原液体培养基菌液中加入10% NaCl继续摇床培养。共驯化7 d。最后将驯化后的菌种接种到斜面培养基上，待生长良好，放置于 4 ℃冰箱内保藏。

1.3.4 原料杀菌工艺的选择

为防止低盐虾头酱受腐败微生物影响，设计蒸汽杀菌、巴氏杀菌和干炒杀菌 3种杀菌工艺对虾头酱原料进行杀菌，蒸汽杀菌分别采用 7′30″、5′30″、4′30″和 3′30″的杀菌时间进行处理；巴氏杀菌条件为温度65 ℃、时间30 min；干炒杀菌是将原料干炒至出现虾壳微红，经3种杀菌方式处理后制备的虾头酱于50 ℃发酵16 d，每2 d取样10 g进行感官评定并测定氨基态氮从而选择最优杀菌工艺[26]。

1.3.5 接种比例

菌悬液：从乳酸菌斜面和酵母斜面上挑取菌落至无菌水中，用玻璃珠打散，调整浓度至108cfu/mL。

孢子悬液：从斜面挑取孢子至无菌水中，用玻璃珠打散使孢子浓度达到106cfu/mL。

称取200 g新鲜虾头5份，杀菌，捣碎打浆后，分别放入瓷罐中。制备菌悬液，调整菌悬液浓度为108cfu/mL，按质量分数加入菌种1%、3%、5%、7%、9%，食盐添加量为18%，存放在温度50℃的恒温培养箱中。每2 d取样，测定各组样品的氨基态氮浓度，结合感官评定，确定较适的菌种接种量。

1.3.6 虾头酱的制备

取新鲜虾头200 g，挑选去杂，按比例加入18 %的食盐，杀菌，捣碎打浆后至于瓷罐中，按比例接种混合发酵剂，发酵至成熟，杀菌制成成品。

1.3.7 虾头酱快速发酵单因素影响试验

1）发酵温度。固定发酵时间为15 d，发酵剂接种量为1 mL/100g 的条件下，分别选取发酵温度30、40、50、60和70℃，对发酵成熟的虾头酱进行感官评价及氨基态氮含量测定，确定最佳发酵温度。

2）发酵时间。固定发酵温度为50℃，发酵剂接种量为1 mL/100g的条件下，分别选取发酵时间4、8、12、16和 20 d，对发酵成熟的虾头酱进行感官评价及氨基态氮浓度测定，确定最佳的发酵时间。

3）混合发酵剂的接种量。固定发酵温度为 50 ℃，发酵时间为15 d的条件下，分别选取发酵剂接种量1、3、5、7、9 mL/100g，对发酵成熟的虾头酱进行感官评价及氨基态氮浓度测定，确定最佳的发酵剂接种量。

1.3.8 响应面法优化虾头酱快速发酵工艺

据单因素试验结果，确定发酵菌株混合比例为 1∶5∶3，对影响虾头酱感官评价的主要因素发酵温度、发酵时间和发酵剂接种量进行中心组合试验设计(Box-Behnken)[27-28]，设计因素编码和水平，见表2。

表2 因素水平编码表Table 2 Code of factors and levels

2 结果与分析

2.1 杀菌工艺选择

对虾头酱原料进行蒸汽杀菌、巴氏杀菌和干炒杀菌处理后，3种虾头酱于50℃培养箱中发酵16 d后的氨基态氮及感官评价得分变化见图1。

图1 不同杀菌方式对氨基态氮和感官评价的影响Fig.1 Effect of different sterilization ways on amino nitrogen content and sensory evaluation

杀菌后的虾头酱经16 d发酵，均无变质腐败的现象，但发酵程度却有所不同。由图1可知，杀菌后，仅巴氏杀菌的氨基态氮浓度较高，说明其发酵程度较高，且风味较好，而经过其他杀菌方式的样品在发酵程度和风味上都略差，因此，结合实际操作，选择巴氏杀菌处理原料。

2.2 发酵菌株混合比例的确定

蛋白质在微生物的作用下分解产生氨基酸，而氨基态氮是以氨基酸形式存在的氮元素浓度，是判断食品发酵程度的重要指标[29-30]，以氨基态氮含量变化为指标，确定混合菌株的接种比例，如图 2是接种不同浓度的酵母菌、乳酸菌和霉菌对氨基态氮的影响。

由图2a可知，酵母菌的接种量为1 mL/100g 时氨基态氮浓度最高，表明此接种量下虾头酱的发酵程度最好，故酵母菌的最适接种量为1 mL/100g；由图2b可知，乳酸菌接种量为 5 mL/100g时的氨基态氮浓度最高；由图 2c可知，霉菌的最佳最适接种量为3 mL/100g。根据3株菌的最适接种量，确定季氏毕赤氏酵母菌、植物乳杆菌和黑曲霉菌的混合比例为1∶5∶3。

图2 接种不同浓度菌对发酵过程氨基态氮浓度的影响Fig.2 Effects of different inoculum concentrations of,bacteria on amino nitrogen in fermentation

2.3 单因素试验结果

以感官品评以及氨基态氮浓度为指标，发酵温度、发酵时间、发酵剂接种量等各单因素影响试验结果如图3所示。由图3a可知，发酵温度在50 ℃时，虾头酱已具有发酵香气，风味良好，感官评价得分 7.49，为此时氨基态氮浓度为(0.81±0.02) mg/mL。当温度低于40℃时，酶和微生物代谢活动缓慢，发酵过程缓慢，特征风味不明显，感官评分较低；当温度高于 60℃时，体系中的酶和微生物作用受到抑制，代谢活动降低，致使感官评分较低，鲜味不足，氨基态氮浓度也因微生物代谢减慢而有所下降，因此选取 50℃为最适发酵温度。随着发酵时间的延长，风味逐渐形成并趋于成熟，发酵时间在12 d以后氨基态氮浓度增长缓慢，16 d后几乎没有增加，感官评分在12 d时最高，随着发酵的继续进行虾头酱的感官评价得分下降，因此选择12 d发酵较宜，此时氨基态氮浓度为(0.79±0.01) mg/mL。随着接种量的增加感官评价和氨基态氮浓度呈现先升高再降低的趋势，当接种量为3 mL/100g 时感官评分达到最高，此时风味柔和，酱香明显；当接种量高于5 mL/100g 时，随着接种量的增加，风味品质变差，氨基态氮浓度也逐渐降低，可能是由于乳酸菌和酵母菌的增加，出现了轻微的酸味、酵母味和酒精味，导致香气不纯感官评分降低，且微生物利用氮源量增加使得氨基态氮浓度下降，故选择接种量3 mL/100g为最适接种量，此时氨基态氮浓度为（0.82±0.01）mg/mL。

图3 发酵温度、发酵时间、发酵剂接种量对发酵过程的影响Fig.3 Effect of temperature, time, and inoculation quantity on fermentation

2.4 Box-Behnken试验结果拟合

基于Box-Behnken试验设计，以感官评价为响应值，进行二次多项回归方程拟合及分析。试验设计及结果见表3。

表3 Box-Behnken设计及结果Table 3 Box-Behnken design and results

对表 3中试验数据进行多项式拟合回归，以感官评分为因变量，发酵温度、发酵时间、发酵剂接种量为自变量，得到二次多元回归方程：Y=7.513+0.399X1+0.469X2–0.108X3–0.360X1X2+0.073X1X3–0.073X2X3–0.339X12–0.504X22–0.177X32

对该模型进行方差分析，结果见表4。从表4可知，回归方程显著(P=0.008)，失拟项具有不显著性(P=0.060＞0.05)，预测值与试验值具有高度相关性(R2=0.953)。拟合程度＞90%，说明该模型能很好的反应响应值的变化，能利用该模型对感官评分进行很好的分析和预测。由表3还可以看出因素 X1、X2、X22对感官评分有极显著的影响(P＜0.01)，X1X2、X12对虾头酱感官评分的交互作用显著(P＜0.05)。各因子的贡献率为：X2>X1>X3，即发酵时间>发酵温度>接种量。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

2.5 响应面分析与优化

根据二次回归方程，建立响应曲面图，各因素交互作用对响应值的影响结果见图4。由图可知，响应面及等高线可直观地反映出发酵温度、发酵时间、接种量及其交互作用对响应值的影响，并确定各个因素的最佳水平。等高线形状可以反映因素之间交互作用大小，当为椭圆形时，表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。图4a中，接种量固定在零水平时，感官评分随着发酵温度和发酵时间的升高而增加，达到最大值后开始降低，其等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。图4b中，发酵时间固定在零水平时，感官评分随着发酵温度的升高而增加，达到最大值后呈下降趋势，随着接种量的升高先增加，随后呈下降趋势，坡度较缓，从等高线可知发酵温度与接种量的交互作用不显著。图4c中，发酵温度固定在零水平时，感官评价随着发酵时间和接种量的升高而增加，之后呈下降趋势，坡度较缓，从等高线可知其交互作用为不显著。

图4 发酵温度、发酵时间和接种量各因素对虾头酱感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature, time, and inoculation quantity on sensory evaluation of shrimp head paste

2.6 最佳工艺条件的确定和模型验证试验

通过回归方程求解优化后的最佳工艺参数为：发酵温度 53.6℃，发酵时间 13.46 d，混合发酵剂接种量是2.69 mL/100g，此时的感官评分为 7.68。由于要考虑实际生产，选择优化后条件为：温度54℃，发酵时间14 d，发酵剂接种量 2.5 mL/100g。为验证虾头酱工艺优化后的可行性与科学性，在此条件下进行验证试验，通过 3组平行试验对快速发酵虾头酱及传统发酵虾酱进行感官评价及氨基态氮浓度检测对比，如图 5所示。由图可知结果表明感官评价平均值为 7.64与预测值相对误差为0.521%，此时氨基态氮浓度为（0.82± 0.04） mg/mL；对比快速发酵虾头酱与传统虾酱感官评价得分可以发现两者等分相近，虽然快速发酵虾头酱在发酵味较传统发酵虾酱低，但是快速发酵虾头酱的盐含量有所降低；氨基酸态氮是判断发酵产品发酵程度的重要指标，代表发酵制品中氨基酸的浓度，浓度越高，则鲜味越好，且发酵程度越高[29-30]，故对比 2款产品的氨基态氮浓度可以发现，快速发酵虾头酱的氨基态氮浓度较低，可能是因为虾头酱的原料虾头本身蛋白含量较低，导致最终产品中氨基态氮浓度略低，验证试验结果表明快速发酵工艺可以在较短时间内使产品发酵成熟，形成风味较好的虾头酱，说明发酵工艺参数准确可靠。

图5 传统发酵虾酱与快速发酵虾头酱对比Fig.5 Comparison between traditional fermented shrimp paste and rapid fermented shrimp head paste

3 结 论

本论文以氨基态氮和感官评价为指标，选择巴氏杀菌工艺。确定了酵母菌、霉菌和乳酸菌的混合比例为1∶5∶3。通过优化试验设计，确定了虾头酱快速发酵最佳工艺条件为：发酵温度为54℃，发酵时间为14 d，混合发酵剂接种量为 2.5 mL/100g，在最佳工艺条件下发酵制备虾头酱的感官评价得分为7.64，氨基态氮浓度为（0.82±0.04） mg/mL。

通过外加微生物发酵手段，研究的快速发酵技术能在较短时间内分解蛋白质，产生氨基酸等呈味物质，发酵剂能在较短时间内发挥作用，提高发酵速率，并控制虾头酱品质，进一步促进了发酵过程的缩短。采用现代快速发酵技术制备虾头酱，具有低盐、发酵时间短、产品性质稳定等优势，是未来产业化的研究方向，提高了虾副产物的高值化利用。

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