稀释液冻干粉剂低温超长时间保存绵羊精液效果

王 杰 ，李 娜 ，肖国亮 ，赵建清 ，高庆华 ，3

（1.塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300；2.塔里木大学生命科学学院，阿拉尔 843300；3.新疆建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；4.新疆喀什地区畜牧工作站，喀什 844000）

精液低温保存操作简单，精子存活率较高，保存效果好，受胎率高。绵羊精液体外长时间保存在很大程度上打破了时间、空间对种公羊种用性能的限制，在实际生产中最为常用。1961年Nishikawa等［1］在4℃下低温保存山羊精液15 d，精子在第6天时仍然有受精能力。2011年Ashrafi等［2］使用冷冻稀释液保存精液 60 h，精子活率达到46.4%。邹宇银等［3］低温保存绵羊精液214 h，精子活率达55%以上；陈晓丽等［4］低温保存精液

12 d，精子活率达到49%。低温保存9 d已经属于超长时间保存，该稀释液使绵羊精液低温超长时间保存后应用于生产成为了可能。传统绵羊精液低温保存稀释剂主要是液态形式，稀释液保存、运输比较麻烦。粉剂稀释液的研究，可以规范稀释液的生产流程，降低稀释液的保存条件，扩大稀释液的适用范围以及实现稀释液的商品化。粉剂稀释液有固体混合和液体干燥两种方法，由于本试验所使用原稀释液中约有20%的卵黄，所以采取冷冻干燥的方法来获得原稀释液的冻干粉剂。粉剂稀释液用于绵羊精液低温保存的报道较少，因此本试验拟利用新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室研制的绵羊精液长期保存的TRIS专利稀释液，经过干燥工艺制成粉剂稀释液，以进行粉剂稀释液对绵羊精液低温长时间保存的可行性研究。

1 材料与方法

1.1 粉剂稀释液的制备

使用本实验室主要成分为三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、三磷酸腺苷、果糖、卵黄的TRIS专利稀释液，每5毫升分装到试管中，在－80℃冰箱中冷冻12 h后在真空冷冻干燥器中完全干燥后取出避光保存，稀释精液前将粉剂稀释液用双蒸水定容至5 mL混匀备用。

1.2 精液采集与保存

选取6只4岁体况较好且无繁殖障碍的盘羊与巴什拜羊杂交公羊，在采精前1个月饲喂胡萝卜，试验前1周用假阴道法采精3次，试验中将每头每次假阴道法采集的精液平均分为2份，分别与经过干燥处理过的稀释液（A组）和未经过干燥处理稀释原液（B组）按照1∶4混合，水浴在冰箱中2 h降温至0℃，并在冰水混合物中保存。

1.3 精液品质鉴定

精子活率检测，在第0、1、3、6、9、12天将粉剂稀释液组（A组）和原稀释液组（B组）分别各取5 μL精液滴在载玻片上，盖上盖玻片，放在37℃热台上，在400倍显微镜下检测，观察精子活率并记录。

精子顶体完整率检测，在第 0、1、3、6、9、12 天将 A组和B组各吸取一滴精液滴于载玻片的左端，用另一张边缘光滑的载玻片呈35°角自右面接触液滴，拉向另一侧，制成抹片，经自然风干5～10 min后，用福尔马林磷酸盐固定液固定15 min，再经水洗干燥后，用姬姆萨染液对抹片精子染色90 min，再用蒸馏水冲洗、干燥，显微镜下观察顶体完整的精子数并记录。

1.4 受胎率检测

用低温保存第9天的精液（精子活率大于0.5）对297只发情母羊A组（154只）和B组（143只）采用常规试情和人工授精，40 d用B超统计受胎情况。

1.5 数据的统计分析

精子活率和顶体完整率用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，受胎率用SPSS 17.0统计软件进行卡方检验。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 低温保存对绵羊精液精子活率的影响

由表1可知，A、B两组稀释剂的精子活率均随时间推移逐渐下降，从第3天开始B组平均精子活率均高于A组，且随着时间推移差值逐渐变大。经过统计比较发现，A组与B组低温保存下精子活率在各时间点差异均不显著（P＞0.05）。在第9天A组和B组精子活率均高于0.5，满足鲜精输精要求。

表1 两组稀释剂低温保存绵羊精液不同时间的精子活率

2.2 低温保存对绵羊精液精子顶体完整率的影响

从表2可见，两稀释剂组的精子顶体完整率均随时间推移逐渐下降，从第1天开始B组顶体完整率均高于A组，经过统计比较发现，A组与B组低温保存下精子顶体完整率在各时间点差异均不显著（P＞0.05）。A、B两组在第6天到第9天精子顶体完整率下降较快，在第9天两组顶体完整率均高于65%。

表2 两组稀释剂低温保存绵羊精液不同时间精子顶体完整率%

2.3 低温保存对绵羊精液受胎率的影响

A组低温保存绵羊精液，在第9天人工授精154只，有103只妊娠，受胎率达66.9%；B组第9天人工授精143只，有97只妊娠，受胎率67.8%。

3 讨论

精子活率是精液品质检测中最重要的检测指标，精子活率的高低直接影响人工授精的成功率。本试验A组与B组在各时间点的精子活率差异均不显著（P＞0.05），在试验第12天B组与A组的精子活率分别为0.47±0.04 和 0.44±0.04，略低于陈晓丽等［4］的试验结果（0.49±0.01），但优于孟娜娜等［5］的试验结果。但 A 组在第9天精子活率为0.53±0.04，可以认为粉剂稀释液在低温保存9 d内精子活率能满足输精要求。

顶体反应是哺乳动物受精的重要环节，只有具有完整顶体的精子才有受精的可能。本试验A组与B组在各时间点的精子顶体完整率差异均不显著（P＞0.05），A组在第6天的顶体完整率（85.1±1.1）%优于赵金红等［6］保存5 d的顶体完整率，但随时间推移顶体完整率逐渐下降，在第6天以后顶体完整率下降速度加快。薛昌安［7］的研究结果表明，在第6天以后渗透压对绵羊精子顶体完整率的影响差异显著（P＜0.05），且随着时间推移不同渗透压之间差异逐渐变大［8］。与本试验顶体完整率在保存6 d以后迅速下降的试验结果一致。本试验还表明，A、B两组精子在低温保存第9天的顶体完整率仍然均高于65%。

人工授精是现代化饲养管理中非常重要的繁殖技术，受胎率的高低是对人工授精结果的直接反映。在经过精液品质检测后发现第9天A组与B组精子活率均高于0.5，且顶体完整率均高于65%，所以本试验用低温保存第9天时的精液对297只发情绵羊进行人工授精，A组与B组的受胎率分别为66.9%和67.8%。本试验结果优于谭建宁等［8］使用冻精人工授精和白丁平等［9］使用1.2亿有效精子数鲜精的受胎率，低于王柏山等［10］使用鲜精的受胎率（76.6%）。可能是体外保存时间较长精子受精能力减弱，或因为输精有效精子数不同。所以，本试验结果表明，利用本实验室专利绵羊稀释液经过干燥处理制成粉剂，对精子保存能力与原稀释液差异不显著（P＞0.05），说明稀释液冻干粉剂能够对绵羊精液进行低温长时间保存。

4 结论

粉剂稀释液与原稀释液低温长时间保存绵羊精子，在保存第9天精子活率均能够达到0.5，顶体完整率均高于65%，粉剂稀释液与原稀释液对精子活率和顶体完整率的保护能力无明显差异；粉剂稀释液与原稀释液在低温保存精液的第9天后进行人工授精，受胎率分别为66.9%和67.8%，差异不显著（P＞0.05）。表明粉剂稀释液可以替代液体稀释液低温保存绵羊精子并进行人工授精。

［1］Nishikawa Y，Torigai Y，Tachikawa M，et al.Experiments on conception with spermatozoa preserved with neospmnan prepared exclusively for goat use［J］.Anim，1961，21（1）：67-73.

［2］Ashrafi I，Kohram H，Naijian H，et al.Protective effect of melatonin on sperm motility parameters on liquid storage of ram semen at 5 degrees C［J］.Afr J Biotechnol，2011，10（34）：6670-6674.

［3］邹宇银，马梦婷，安丹，等.绵羊鲜精长效保存稀释液海藻糖浓度优化试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2017（13）：107-109.

［4］陈晓利，郑永富，王杰，等.超长时间低温保存绵羊鲜精活率和DNA完整性的比较［J］.黑龙江畜牧兽医，2017（20）：90-92.

［5］孟娜娜，孙树春，王寒阳，等.绵羊精液4℃液态保存的稀释液配方优化研究［J］.中国畜牧杂志，2015，51（5）：34-38.

［6］赵金红，彭海梅，周鹏，等.酉州乌羊精液品质评定及稀释液配方研究［J］.中国草食动物科学，2014，34（S1）：210-213.

［7］薛昌安.山羊精液保存技术研究［D］.合肥：安徽农业大学，2015.

［8］谭建宁，莫廷新.陶赛特肉羊细管冻精人工授精受胎率的观察［J］.青海畜牧兽医杂志，2008（5）：18-19.

［9］白丁平，田秀娥，陈玉林，等.绵羊同期发情下有效精子数与不返情率关系研究［J］.中国草食动物，2005，25（5）：16-18.

［10］王柏山，盖长青.绵羊精液多倍稀释母羊受胎效果［J］.中国养羊，1995（1）：23-24.