大鼠骨髓间充质干细胞的分离、鉴定与冻存及对细胞活性的影响

谢晶晶，李 博，姚 兵，宋 烜，张平超，陆 骅

骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多分化潜能细胞，在骨量维持和骨修复中起了极其重要的作用。然而，随着年龄增加，骨髓MSCs向成骨、成软骨细胞分化的能力减弱，是造成骨质疏松和骨折延缓愈合的直接原因[1]近年来，我国骨质疏松症发病率上升，由此发生的骨折、骨折并发症及重要关节功能丧失的患者增多；自体骨髓MSCs移植治疗骨折不愈合的效果已得到肯定[2-3]，其效果与MSCs数量和活性直接相关；但应用于骨质疏松或骨质疏松骨折治疗的研究尚不多见。本研究以SD大鼠为载体，先采集大鼠MSCs冻存，再制备骨质疏松模型，将采集的MSCs回输至大鼠体内发挥抗骨质疏松作用，主要观察MSCs的分离、鉴定及冻存时间对细胞活性的影响，从而为该类疾病的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级3周龄雄性SD大鼠6只，体重(50±10)g，由中科院上海动物房提供，许可证号：SCXK(沪)2013-0005。

1.2实验仪器与试剂 胎牛血清、双抗、淋巴细胞分离液、胰蛋白酶、RPMI 1640培养液均购自美国Gibco公司；CD29，CD90，CD11B，CD45抗体均购自美国Invitrogen公司；终末期糖基化牛血清白蛋白、牛血清白蛋白均购自美国CALBIOCAM公司；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国SIGMA公司；大鼠骨髓MSCs成骨诱导分化培养基和成脂诱导分化培养基购自赛业生物。

1.3实验方法

1.3.1大鼠骨髓MSCs的分离培养：将3周龄SD雄性大鼠6只全部断颈处死，取股骨和胫骨，并剪去两端，露出骨髓腔，使用含体积分数为10%的胎牛血清+双抗的培养液，冲洗骨髓腔，反复2次，打散细胞悬液后，使用70 μm细胞筛过滤，去除细胞团块。用相对密度1.077的淋巴细胞分离液做梯度离心(2000 r/min，离心30 min)。收集单核细胞界面层，再次离心(1000 r/min，离心10 min)，弃上清后，使用原代细胞培养液打散重悬细胞。细胞悬液接种于100 mm细胞培养皿中，在37℃，体积分数为5%的CO2，饱和湿度条件下培养48 h，然后去除未贴壁细胞，每48 h换液1次。

1.3.2流式细胞法鉴定MSCs表面标志物：原代细胞生长至培养皿95%左右体积时，开始传代培养；以移液器吸取第2代细胞若干，用胰蛋白酶消化、含体积分数为5%胎牛血清的PBS重悬,并调整细胞浓度至1×106/ml；鉴定MSCs表面标记物CD29和CD90及造血干细胞(HSCT)表面标记物CD11B和CD45的阳性表达情况，合格的MSCs应表达CD29和CD90，而不表达CD11B和CD45。主要步骤：每个流式管各取100 μl细胞混悬液，加入待测抗体；设立对照组，取100 μl细胞混悬液加入同型对照抗体；4℃避光孵育30 min，漂洗2次后移除去上清，控干后每管加入0.5 ml固定液，上机检测。先检测同型对照管，调整电压至阴性区范围，再测实待测抗体管[4]。

1.3.3MSCs的冻存：配置MSCs冻存体系，体系构成为10%DMSO+30%胎牛血清+60%DMEM-LG培养基。将培养好的第2代细胞吸除培养液，转移至冻存体系；根据考察时间点，每只大鼠的MSCs均先分装为4管，管1不冻存，直接培养至对数生长期，测定增殖活力和多向分化能力；管2、3、4先置于4℃环境保存2 h，再置于-20℃环境保持2 h，再转移至-70℃超低温环境冻存。

1.3.4MSCs的复苏：管2、3、4分别于冻存1周、1个月、6个月复苏细胞。复苏步骤：将冻存管37℃水浴，至溶解90%左右时移入37℃预热的DMEM培养基，1000 r/min离心5 min，弃上清液，培养基重悬细胞，锥虫蓝染色计数活细胞数目，复苏率=(活细胞数目/总细胞数目)×100%。复苏后的细胞调整为1×108/L，在37℃体积分数为5% CO2，饱和湿度条件下培养72 h，达到对数生长期时，测定其增殖活力和多向分化能力。

1.4MTT法测定MSCs增殖活力 分别于冻存前，冻存1周、1个月、6个月复苏细胞，收集生长至对数期的待测骨髓MSCs，以1×104/ml接种于96孔板，置于37℃体积分数为5% CO2温箱中培养，分别于处理1 d、2 d......7 d吸去上清液，PBS洗涤，弃上清液，每孔加入10 μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 μl MTT溶液(5 g/L，即0.5%)继续培养4 h。弃上清液后，每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速连续振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值，每组设定3个复孔，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.5诱导实验测定MSCs多向分化能力 收集生长至对数期的待测骨髓MSCs，以1×104/ml接种于96孔板中，以大鼠骨髓MSCs成骨诱导分化培养基培养(培养基由MSCs专用胎牛血清、谷氨酰胺、双抗、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠及地塞米松按照一定的配比组成)。37℃，5%CO2培养7 d，隔天换液1次，7 d后吸除剩余培养基，茜素红染色，染色液含5 mg/L茜素红S+0.1M Tris，PH=1，共染色15 min，倒置荧光镜下观察被染红的钙结节数目。按照同样的方法，以大鼠骨髓MSCs成脂分化培养基培养细胞，培养7 d后油红O染色15 min，倒置荧光镜观察被染黄的脂滴形成数目。

2 结果

2.1大鼠骨髓MSCs培养与鉴定 分离自骨髓的细胞在培养1个月后出现细胞克隆，呈纤维细胞样生长。见图1。MSCs细胞表面CD29和CD90的阳性表达率分别为97.9%和97.4%，HSCT细胞表面CD11B和CD45的阳性表达率分别为9.8%和7.7%，同时细胞表面CD11B阴性表达率为90.2%，CD45阴性表达率为92.3%，说明上述纤维细胞样细胞基本为骨髓MSCs，且均一性好。见图2。

图2 流式细胞仪检测2代骨髓间充质干细胞表面标志物

2.2冻存不同时间对大鼠骨髓MSCs增殖活力的影响 冻存1周、1个月和6个月，大鼠骨髓MSCs复苏率分别为68.4%、66.3%、64.8%。随着冻存时间延长，细胞增殖速率稍有减慢，但差异无统计学意义(P>0.05)，冻存6个月的细胞增殖活力也处于较稳定水平内。复苏细胞的增殖曲线见图3。

图3大鼠骨髓间充质干细胞冻存时间对增殖曲线的影响

2.3冻存不同时间对大鼠骨髓MSCs多向分化能力的影响 冻存前、冻存1周、1个月和6个月，大鼠骨髓MSCs成骨诱导后钙结节数目和油滴数目稍有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。成骨分化诱导培养基培养后采用茜素红染色，钙结节被染成棕色，钙结节数目越多，成骨分化能力越强；成脂分化诱导培养基培养后，油红O染色，液化脂肪被染成橙红色，呈油滴状，油滴越多，成脂分化能力越强。见图4。

3 讨论

目前国内大鼠骨髓MSCs的提取方法多采用密度梯度分离法联合贴壁培养手段[5-6]。骨髓所含的细胞种类极为丰富，密度梯度离心可去除骨髓中的红细胞、免疫细胞及脂肪细胞等，贴壁培养的目的在于进一步去除造血干细胞等非贴壁细胞。本研究用该方案提取大鼠MSCs，其优点在于操作简便，所得细胞活性和纯度相对较高，能够满足一般实验需求；获得的细胞MSCs表面CD29和CD90的阳性表达率分别为97.9%，97.4%；MSCs表面和CD11B和CD45的阳性表达率分别为9.8%和7.7%；说明所获得的MSCs纯度可达90%，且均一性较好。

表1 大鼠骨髓间充质干细胞冻存不同时间对多向分化能力的影响

图4骨髓间充质干细胞多向分化诱导实验染色后典型图片(HE×200)

A.成骨分化诱导培养基培养后茜素红染色，着色者为钙结节；B.成脂分化诱导培养基培养后油红O染色，着色者为油滴

冻存和复苏骨髓MSCS非常关键，是保持其应用效果的重要条件之一。既往文献报道[7-8]，与MSCs低温冻存质量密切相关的三要素是降温步骤、冻存液、冻存温度及复苏速率。降温速度主要影响细胞内基质结冰过程中的渗透压，如果直接过度到超低温环境容易引发细胞内溶质反应，进一步引发细胞器损坏和细胞膜渗漏[9-10]，因此需在4℃环境中缓冲2～4 h，本研究采用梯度降温法，4℃和-20℃各缓冲2 h，再转移至-70℃。何洁等[11]指出液氮冻存效果较-70℃环境更好，但基于-70℃环境冻存条件更加方便，本研究直接以-70℃超低温冰箱进行存储。冻存液的配置参照李秀森的改良方案[12]，以10%DMSO+30%胎牛血清+60%DMEM-LG培养基为存储体系。最终考察冻存1周、1个月和6个月的细胞活性，结果显示快速复苏后，大鼠骨髓MSCs 1周，1个月和6个月的复苏率分别为68.4%、66.3%、64.8%，与文献一致[13-14]。

本研究结果显示，MSCs增殖曲线基本符合“S”型规律[15-16]，有较明显的平台期、对数生长期和生长后下降趋势。冻存前、冻存1周、冻存1个月和冻存6个月的增殖曲线较为接近，各个时间点的增殖速率差异无统计学意义。多向分化能力是MSCs的典型重要特征，是指在特定的诱导条件下，MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞或脂肪细胞，这也是MSCs可通过归巢效应治疗多种疾病的根本原因[17]。本研究结果显示，随着冻存时间延长，大鼠骨髓MSCs成骨和成脂肪能力与治疗前比较差异无统计学意义，证实在6个月的冻存期内，细胞活性得到了良好的保持。

综上所述，采用密度梯度分离法联合贴壁培养可成功提取大鼠骨髓MSCs；配置的冻存体系也可在-70℃超低温环境中较长时间保持MSCs活性，有利于其后续研究。

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