富硒黄白侧耳子实体蛋白质和多糖的研究*

王 华，刘 虹，刘 欣，南晓洁

（山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030006）

硒对人体有很多有益的功效，如提高免疫系统活性、降低患癌风险和化疗副作用，以及降低癌细胞转移活性等[1-3]，可以通过摄入适量的硒来强化人体内源性抗氧化系统，以达到辅助治疗某些疾病的目的[4]。硒一般以无机硒和有机硒2种形式存在，其中以有机硒复合物和硒-氨基酸的生物活性最高[5]。与直接摄入无机硒相比，从天然食品中获取有机硒对人体更健康[6]。虽然我们可以从食物中获得硒，如坚果、鸡蛋、鱼、肝和鸡肉等，但是，在天然食物中硒的含量很低，因此寻找富含硒的膳食来源很重要。众所周知，食用菌具有较强的富集矿物元素的能力，富硒食用菌蛋白可以显著提高食用菌的营养价值[7-8]。侧耳属（Pleurotus spp.）食用菌基于其较高的食用价值和药用价值，以及在生物技术应用和环境应用等方面的优势，在全球广泛栽培，其栽培规模仅次于双孢蘑菇（Agaricus bisporus），位居第二[9]。黄白侧耳（Pleurotus geesteranus），又名秀珍菇，由于其较好的口感，含有高膳食纤维和高品质的蛋白而备受人们喜爱[10-11]。大多数富硒栽培食用菌的研究都是采用无机硒作为硒源，以有机硒作为硒源来栽培获得富硒食用菌的研究较少。

本试验旨在以有机硒—硒代蛋氨酸（Se-Met）为硒源，采用传统栽培方式获得富硒黄白侧耳子实体，分析评价培养料中不同硒浓度对子实体产量、硒含量、可溶性蛋白含量和粗多糖含量的影响，并对其可溶性蛋白和多糖中的硒含量进行测定与分析，以探究富硒黄白侧耳中硒的存在形式。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄白侧耳（Pleurotus geesteranus）由本实验室提供，保存在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上。

1.2 材料

硒代蛋氨酸（Se-Met）由山西大学化学化工学院提供；棉籽壳和麦麸购自太原市小店区。

1.3 黄白侧耳的栽培

基础培养料配方：棉籽壳93%、麦麸5%、蔗糖1%、石膏1%。

含硒培养料配方：在基础培养料中添加Se-Met，使其质量分数分别达到0.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1和0.8 g·kg-1。

将以上培养料分别配料、拌料并装瓶（500 mL罐头瓶装湿料300 g），然后灭菌、接种，进行发菌期和出菇期管理。记录子实体的产量（鲜重，g·瓶-1）并计算不同培养料的生物学效率。生物学效率（%）为总子实体鲜重除以培养料干重乘以100%。在含硒培养料和基础培养料上所得到的黄白侧耳子实体分别编号为样品A、样品B、样品C和对照。

1.4 富硒黄白侧耳中硒含量的测定

参照文献 [12]，根据吸光度值和硒的浓度绘制硒标准曲线，得到标准曲线的方程为：y=0.434x+0.004（R2=0.99）。在 2 g待测样品中加入 30 mL H2SO4和HNO3（1∶4）混合酸，进行充分溶解至溶液澄清，按照标准曲线的测定方法，测定并计算待测样品中的硒含量。在本试验中所用到的玻璃器皿均在10%HNO3溶液中浸泡24 h。

1.5 富硒黄白侧耳中可溶性蛋白含量的测定

富硒黄白侧耳中可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250结合法[13]。首先采用牛血清蛋白稀释液绘制标准曲线：y=4.381x－0.007（R2=0.99）。准确称取2.0 g用石油醚脱脂后的子实体样品，加入30 mL双蒸水提取，重复3次。最后将提取液定容至100 mL，按照标准曲线的测定方法，测定并计算待测样品中可溶性蛋白的含量。

1.6 富硒黄白侧耳中粗多糖含量的测定

富硒黄白侧耳中粗多糖的提取参照文献[14]，准确称取2.0 g干燥且粉碎的待测样品，采用NaOH溶液（1 mol·L-1）进行提取，并用95%乙醇进行醇沉，最后将沉淀用蒸馏水溶解并定容。可溶性粗多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[15]。

1.7 可溶性蛋白中硒含量的测定

准确称取5 g脱脂后的样品，依次用双蒸水、NaCl溶液（0.5 mol·L-1）、Na2HPO3-KH2PO3缓冲液（0.067 mol·L-1，pH 6.0）和 Na2HPO3-KH2PO3缓冲液（0.067 mol·L-1，pH 8.5）各提取3次，在所得提取液中分别加入NH4SO4至饱和，置于4℃冰箱中24 h，离心获得沉淀，将沉淀分别在BaCl2溶液中透析至无沉淀产生，然后将所获得的蛋白质再分别溶于上述双蒸水、NaCl溶液（0.5 mol·L-1）、Na2HPO3-KH2PO3缓 冲 液 （0.067 mol·L-1， pH 6.0）和Na2HPO3-KH2PO3缓冲液 （0.067 mol·L-1，pH 8.5）中，分别得到水溶性、盐溶性、弱酸溶性和弱碱溶性的蛋白质溶液[16]。4种蛋白质中的硒含量按照1.4中的方法进行测定。

1.8 可溶性多糖中硒含量的测定

准确称取5 g脱脂后的样品，依次用双蒸水、NaOH溶液（0.1 mol·L-1）和HCl溶液（0.1 mol·L-1）在沸水浴中提取2 h，分别得到水溶性、碱溶性和酸溶性粗多糖溶液，分别用Sevag法除蛋白，并用95%的乙醇进行醇沉，最后将沉淀分别使用双蒸水、NaOH溶液（0.1 mol·L-1）和HCl溶液（0.1 mol·L-1）溶解并定容，即为水溶性、碱溶性和酸溶性多糖溶液[16]。3种多糖中的硒含量按照1.4中的方法进行测定。

1.9 统计学分析

以上试验设3次重复，试验数据用平均值±标准误表示，显著性差异采用Duncan多重比较法进行比较[17]。

2 结果与分析

2.1 Se-Met对富硒黄白侧耳产量、生物学效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影响

Se-Met对富硒黄白侧耳产量、生物学效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影响结果见表1。

表1 Se-Met添加量对黄白侧耳产量、生物学效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影响Tab.1 Effects of Se-Met amount on yield,biology efficiency,Se content,soluble protein and polysaccharide contents of Pleurotus geesteranus fruiting bodies

从表1可以看出，当培养料中Se-Met的浓度为0.4 g·kg-1时，黄白侧耳的产量和生物学效率最高，分别为45.6 g·瓶-1和36.46%，但与对照组相比，并无显著差异（P<0.05）。当培养料中Se-Met的添加量为0.6 g·kg-1和0.8 g·kg-1时，黄白侧耳的产量和生物学效率均显著降低，且明显低于对照组，表明高添加量的硒抑制了黄白侧耳子实体的生长。表1结果还显示，黄白侧耳子实体中硒的含量，随培养料中Se-Met添加量的提高而提高，相关性分析结果表明，子实体中的硒含量与培养料中Se-Met的添加量呈显著正相关性（R2=0.98，P<0.01），当培养料中Se-Met的添加量为0.88 g·kg-1时，子实体中的硒含量最高，达到11.43 μg·g-1。此外，表1结果还表明，当培养料中硒的添加量为0.4 g·kg-1时，黄白侧耳的可溶性蛋白含量显著高于其他组，达到45.82%。当培养料中硒的添加量超过0.4 g·kg-1后，黄白侧耳子实体中的可溶性蛋白含量，随培养料中Se-Met添加量的提高而逐渐降低。而黄白侧耳子实体中的粗多糖含量则是随培养料中Se-Met添加量的提高而逐渐提高，相关性分析结果表明，子实体中的粗多糖含量与培养料中Se-Met添加量有显著正相关性（R2=0.99，P<0.01）。当培养料中硒的添加量为0.8 g·kg-1时，黄白侧耳的粗多糖含量最高，达到9.26%。

2.2 富硒黄白侧耳中可溶性蛋白中的硒含量

分别对富硒黄白侧耳子实体中的水溶性蛋白、盐溶性蛋白、弱酸溶性蛋白和弱碱溶性蛋白进行了分离，并对其中的硒含量进行了测定与比较，结果见图1和表2。

图1 富硒黄白侧耳子实体可溶性蛋白中的硒含量Fig.1 Selenium content in soluble protein of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies

由图1和表2可以看出，在样品A、样品B和样品C中，蛋白质中的硒含量排序为：水溶性蛋白>弱碱溶性蛋白>盐溶性蛋白>弱酸溶性蛋白，且四者之间存在显著差异（P＜0.05）。此外，对所分离到的蛋白质中的硒含量占总硒含量的比例进行了计算与分析，结果如表2所显示，富硒黄白侧耳子实体中的硒主要存在于水溶性蛋白中，样品A、样品B和样品C的水溶性蛋白中的硒含量分别占总硒含量的27.22%、28.94%和27.96%，3个样品可溶性蛋白（包括水溶性蛋白、盐溶性蛋白、弱酸溶性蛋白和弱碱溶性蛋白）中的硒含量分别占总硒含量的53.02%、57.39%和54.30%，这说明富硒黄白侧耳中的硒主要以硒蛋白的形式存在。

表2 富硒黄白侧耳子实体可溶性蛋白中的硒占总硒含量的比例Tab.2 Proportion of selenium content in soluble protein of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies accounts for the total selenium content

2.3 富硒黄白侧耳多糖中的硒含量

分别对富硒黄白侧耳子实体中的水溶性多糖、酸溶性多糖和碱溶性多糖进行了分离，并对其中的硒含量进行了测定与比较，结果见图2和表3。

图2 富硒黄白侧耳多糖中的硒含量Fig.2 Selenium content in polysaccharide of selenium-enriched Pleurotus geesteranus

由图2和表3可以看出，在样品A、样品B和样品C中，多糖中的硒含量排序为：水溶性多糖>酸溶性多糖>碱溶性多糖，且三者之间存在显著差异（P＜0.05）。此外，对所分离到的多糖中的硒含量占总硒含量的比例进行了计算与分析，表3结果表明，在富硒黄白侧耳子实体中，硒主要存在于水溶性多糖中，样品A、样品B和样品C的水溶性多糖中的硒含量分别占总硒含量的10.63%、11.06%和11.42%，3种多糖（包括水溶性多糖、酸溶性多糖和碱溶性多糖）中的硒含量分别占总硒含量的23.26%、23.96%和24.98%。

表3 富硒黄白侧耳子实体多糖中的硒占总硒含量的比例Tab.3 Proportion of selenium content in polysaccharide of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies accounts for the total selenium content

3 讨论

关于富硒栽培食用菌已被广泛报道，在已有的文献报道中大多是以无机硒作为硒源来获得富硒食用菌[18-19]。Silva等[19]的研究结果表明，在栽培平菇（Pleurotus ostreatus）的培养料中添加亚硒酸钠时，平菇可以富集培养料中的硒，而且子实体中的硒含量与培养料中亚硒酸钠的添加量呈正比。这一结果与本试验所取得的结果是一致的：黄白侧耳中的硒含量与培养料中Se-Met的添加量呈显著正相关性。在本试验中，当培养料中Se-Met添加量为0.8 g·kg-1时，黄白侧耳子实体中硒含量可达到11.43 μg·g-1，这表明Se-Met适宜作为富硒栽培黄白侧耳硒源。关于培养料中Se-Met添加量对富硒黄白侧耳子实体产量和生物学效率的影响，本试验只是做了初步探究，在后续工作中有必要对Se-Met的添加量进行细化分析，以便更系统地反映Se-Met对富硒黄白侧耳生长的影响。

很多研究都表明，硒在富硒食用菌子实体中大多与蛋白质或者多糖结合在一起，而且在培养料中添加硒会影响富硒食用菌中蛋白质和多糖等有机物的合成[20]。Zhao等[6]的结果表明，在培养基质中添加低浓度的亚硒酸钠会促进灵芝（Ganoderma spp.）总蛋白质和氨基酸的合成，但是高浓度的硒却有相反的作用。在本试验所选的硒添加量范围内，培养料中低添加量的Se-Met有利于富硒黄白侧耳中水溶性蛋白质含量的提高，随着培养料中Se-Met添加量的提高，富硒黄白侧耳中的水溶性蛋白质含量反而呈现下降的趋势。这说明一定添加量的Se-Met可以促进蛋白质的合成，这与Zhao等的结果是一致的。富硒黄白侧耳中的硒含量与多糖含量呈显著正相关性，这说明一定添加量的硒也可以促进多糖的合成。同样，进一步细化Se-Met的添加量，以更系统地反映Se-Met对富硒黄白侧耳子实体中各营养成分的影响及其富集形式是很有必要的。此外，培养料中Se-Met对黄白侧耳子实体中蛋白质和多糖代谢的影响机理还有待于进一步探究。

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