3株非酿酒酵母在模拟葡萄汁中的 生长特性与发酵香气

原苗苗,赵新节,姜凯凯,孙玉霞,王世平

(1.齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室,山东济南 250353;2.山东省农业科学院农产品研究所,山东省农产品精深加工技术重点实验室，农业部新食品资源加工重点实验室,山东济南 250100)

香气是评判葡萄酒品质的重要特征之一。葡萄酒的香气可以分为三类:品种香,由葡萄品种决定;发酵香,发酵期间产生的;陈酿香,陈酿过程中微生物产生的香气物质和从橡木桶萃取的香气物质的转化形成的[1]。其中酒精发酵过程中微生物(主要是酵母菌)代谢产生的数百种化合物对葡萄酒的香气成分起到了主导作用。

葡萄酒发酵是一个以酵母为主导的复杂的微生物过程。葡萄汁中存在各种非酿酒酵母,它们一般在发酵前期生长旺盛,能够产生较高含量的香气物质[2]。近年来研究发现,非酿酒酵母能够产生大量的酯类、高级醇、甘油、醛和琥珀酸等代谢产物,并且能产生一些酶将葡萄酒中的香气前体物质分解从而释放出香气物质,对葡萄酒的风味产生积极影响,使葡萄酒具有更加复杂的口感和香气[3]。Soden等[4]研究发现,星形假丝酵母比酿酒酵母能产生更多的甘油、醋酸和更强烈的蜂蜜、杏、泡菜和乙酸乙酯香。有孢汉逊酵母和毕赤酵母具有非常好的产乙酸酯的能力[5]。有研究表明,发酵过程中克勒克酵母数量较少是导致西班牙Basque地区白福尔葡萄酒缺乏复杂香气的原因之一[6]。有孢汉逊酵母、德巴利酵母和德克酵母比酿酒酵母具有更强的产糖苷酶能力[7]。因此,筛选出具有优良发酵特性和产香特点的非酿酒酵母菌株并将其应用于葡萄酒酿造中有非常重要的意义。

Powles等[8]研究发现,美极梅氏酵母协同酿酒酵母共同培养时,萜烯和内酯等芳香族化合物含量变化显著。葡萄汁有孢汉逊酵母能产生较低含量的高级醇[9],较高含量的酯类[10],乙酸和乙醛的产量因菌株而异[11]。浅白隐球酵母常常被报道出现在葡萄汁发酵过程中[12],但尚未发现关于其酿酒特性和香气的研究。

本实验在模拟葡萄汁培养基中以前期实验中优选的三株非酿酒酵母(葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、浅白隐球酵母均筛自我国葡萄酒产区)为对象,以酿酒酵母为对照,研究三种非酿酒酵母在模拟葡萄汁培养基上的生长特点,并应用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析其发酵香气的差异,为非酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄汁有孢汉逊酵母(Hansenisporauvarum) 分离自河北朗格斯酒庄葡萄园的赤霞珠葡萄;美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima) 分离自新疆222兵团酿酒葡萄生产基地的赤霞珠葡萄;浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus) 分离自新疆222兵团酿酒葡萄生产基地的赤霞珠葡萄;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)LALVIN DV10 上海康禧食品饮业有限公司;模拟葡萄汁培养基(model synthetic medium,MSM)、脂肪酸溶液 招远拓扑生物工程有限公司;YPDA固体培养基 1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂,115 ℃灭菌30 min;YPD液体培养基 1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖,115 ℃灭菌30 min。

Biotek Synergy HTX多功能微孔板检测仪 美国伯腾仪器有限公司;PAL RSI85自动进样器 瑞士CTC公司;GC-7890B/MS-5977A气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;DB-WAX毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美国Agilent公司;57329-U萃取头DVB/CAR/PDMS50/30 μm 美国SUPELCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线测定

1.2.1.1 酵母活化 在YPDA固体培养基上挑取非酿酒酵母菌株接种于YPD液体培养基中,于28 ℃、170 r/min条件下培养24 h制成种子液。

1.2.1.2 生长曲线测定 将各酵母种子液以1%的接种量接种于YPD液体和MSM培养基中,28 ℃条件下培养,每隔2 h取200 μL菌液于96 孔板中,使用Biotek Synergy HTX多功能微孔板检测仪在600 nm波长处测定菌悬液的OD值,每个样品重复测定3 次。然后根据时间和OD600 nm值绘制生长曲线。

1.2.2 模拟葡萄汁发酵 将各非酿酒酵母种子液以1%的接种量接种于MSM培养基中,并于28 ℃培养14 d得到发酵酒样,每个样品设3个重复。

1.2.3 挥发性化合物测定 酒样的挥发性化合物采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定[13-14]。香气化合物使用配带有PAL自动进样器的7890B/5977A气相色谱法质谱联用仪检测,选择DB-WAX毛细管色谱柱,顶空固相微萃取进样,20 mL顶空瓶中加入2 g氯化钠,8 mL样品以及20 μL内标(4-甲基-2-戊醇,浓度2.000 g/L),45 ℃预热顶空瓶10 min,萃取头萃取顶空瓶液面上方气体45 min,萃取过程顶空瓶在Agitator中不停摇动,萃取头在进样口250 ℃解析10 min,采用不分流模式进样,恒流模式,柱流量0.8 mL/min,程序升温,初始温度40 ℃,以1 ℃/min升到45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到84 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到120 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升到200 ℃,以5 ℃/min升到230 ℃,运行时间71.667 min,MSD传输线250 °C,质谱选择SCAN模式进行扫描。

1.2.4 挥发性化合物的分析 用GC-MS内置比色谱库NIST14检索匹配,并结合保留指数定性,用内标法定量。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0进行数据分析,多组间比较采用One-Way ANOVA法。采用SPSS 19.0进行主成分分析(PCA)得到得分图,从而获得样品分类信息。香气活性值(OAV)计算:香气化合物浓度/阈值。

2 结果与分析

2.1 非酿酒酵母生长曲线

如图1、图2所示,浅白隐球酵母在MSM培养基和YPD液体培养基中分别经历了大约20 h和6 h的延滞期后进入了对数生长期,分别在46 h和26 h左右达到稳定期,说明浅白隐球酵母在YPD液体培养基中的生长更好,在MSM培养基中的适应性较差,可能是培养基中的某种营养成分不适合浅白隐球酵母。美极梅奇酵母在MSM培养基和YPD液体培养基中均经历了大约6 h的延滞期后进入了对数生长期,分别在46 h和30 h左右达到稳定期,说明美极梅奇酵母在两种培养基中的适应性较好。在郭东起等[15]的研究中,美极梅奇酵母在YPD培养基中的生长曲线是0～10 h为延滞期,10～22 h为对数期,22～30 h为稳定期,30 h后为衰亡期。这可能是美极梅奇酵母的不同菌株间产生的差异。葡萄汁有孢汉逊酵母在MSM培养基和YPD液体培养基中分别经历了约6 h和4 h的延滞期后进入了对数生长期,分别于40 h和12 h左右达到稳定期,说明葡萄汁有孢汉逊酵母在两种培养基中的适应性最好。酿酒酵母DV10在MSM培养基和YPD液体培养基中分别经历了约20 h和12 h的延滞期后也进入了对数生长期,分别于46 h和36 h左右达到稳定期,说明酿酒酵母DV10在发酵前期的适应时间较长。在李秀萍等[16]的研究中,优选酿酒酵母在甘蔗汁培养基中的生长曲线是0～8 h为延滞期,8～18 h为对数期,18 h后为稳定期。这也说明不同酿酒酵母菌株,在不同培养基中的生长表现不同。

图1 不同酵母在MSM培养基中的生长曲线Fig.1 Growth curves of different yeast strains in model synthetic medium

图2 不同酵母在YPD培养基中的生长曲线Fig.2 Growth curves of different yeast strains in YPD medium

由此可见,酵母在不同培养基中的生长曲线有显著差异,在MSM培养基中生长曲线平滑且持续时间较长,并且延滞期及对数生长期的分界点不明显;而在YPD液体培养基中延滞期和对数生长期很明显;说明两种培养基中的营养成分差异对酵母生长的影响很大,间接证明了葡萄酒生产中产区(不同产区葡萄汁成分差异)对葡萄酒品质的影响。葡萄汁有孢汉逊酵母的适应能力最优,其次是美极梅奇酵母,然后是浅白隐球酵母,酿酒酵母DV10的适应能力最差。这说明非酿酒酵母能在前期迅速繁殖,占据一定数量优势,这与葡萄酒自然发酵过程一致,即非酿酒酵母在发酵前3～4 d占据数量优势,随后酿酒酵母逐步占据主导地位[1]。

2.2 模拟葡萄汁培养基中不同酵母的发酵香气分析

2.2.1 醇类 醇类主要是酵母代谢产生的次级产物[17],大部分来自于氨基酸,通过酵母埃利希代谢途径(Ehrlich metabolic pathway)[18-19],少部分来自于酵母对相应醛类的还原。葡萄酒中的高级醇浓度低于300 mg/L时,有助于提高自身的复杂性;浓度超过400 mg/L,杂醇将会作为一个消极的品质因数,影响葡萄酒的感官品质[20]。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到13种醇类,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生8、9、12、8种醇类。醇类含量由高到低为美极梅奇酵母(94.22 mg/L)、浅白隐球酵母(56.64 mg/L)、DV10(39.15 mg/L)、葡萄汁有孢汉逊酵母(35.38 mg/L)。有研究表明,在发酵葡萄汁中汉逊酵母单独培养产生的醇类比酿酒酵母低[3,9]。在检测的14种醇类中,2-甲基丙醇(异丁醇)、3-甲基丁醇(异戊醇)、2,3-丁二醇在不同酵母发酵的酒样中含量都较高,尤其是3-甲基丁醇对醇类总量贡献最大,起决定性作用。3-甲基丁醇含量最高的是美极梅奇酵母(86.65 mg/L),其次是浅白隐球酵母(49.07 mg/L),最低的是葡萄汁有孢汉逊酵母(30.39 mg/L)。

2.2.2 酯类 酯类主要是酵母酒精发酵过程中产生的,乙酸酯是由细胞内乙酰转移酶催化的高级醇与乙酰辅酶A缩合形成的[21]。大多数酯类具有花、果香气,构成葡萄酒的果香、甜香、苹果、菠萝和花香[22]。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到29种酯类,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生22、9、19、22种酯类。由葡萄汁有孢汉逊酵母产生的酯类含量最高,含量为60.81 mg/L,其中含量较高的为乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯(约为其他三个菌株产量的7倍以上)、9-棕榈酸乙酯,这与Viana等[3]的研究结果一致,汉逊酵母的特点是高产乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯和乙酸-2-苯乙酯。其次是DV10,含量为41.64 mg/L,含量较高的酯类包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯;浅白隐球酵母产生的酯类含量为24.57 mg/L,含量较高的酯类为己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯;产酯最少的为美极梅奇酵母,含量为4.51 mg/L,美极梅奇酵母产量较多的酯为乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯。

表1 不同酵母的发酵香气成分及含量(mg/L)Table 1 Fermentation aroma compounds of different yeasts(mg/L)

2.2.3 酸类 酒中的挥发酸主要来源于酒精发酵,其含量取决于发酵条件、发酵汁的营养水平和所使用的酵母[23]。葡萄酒中通常表现出来的奶酪味以及脂肪味与葡萄酒中存在的有机酸密切相关[24-25]。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到9种酸类,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生8、6、4、7种酸类。由浅白隐球酵母产生的酸类含量最高,含量为6.80 mg/L,其中含量较高的为乙酸、2-甲基丙酸、3-甲基戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸。其次是DV10,含量为4.66 mg/L,含量较高的酸类包括乙酸、2-甲基丁酸、己酸、辛酸。葡萄汁有孢汉逊酵母产生的酸类含量为2.43 mg/L,含量较高的为辛酸。产酸最少的为美极梅奇酵母,含量为0.86 mg/L,与Sadineni等[26]的研究一致,美极梅奇酵母能降低酒中的挥发酸和总酸。

2.2.4 醛酮类化合物 发酵过程中,醛类主要来源于微生物的发酵。氨基酸在酶作用下,转氨基或氧化脱氨基产生醛[27]。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到5种醛酮类化合物,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生4、2、4、4种醛酮类化合物。醛酮类化合物含量由高到低为美极梅奇酵母(3.38 mg/L)、DV10(2.51 mg/L)、浅白隐球酵母(2.26 mg/L)、葡萄汁有孢汉逊酵母(2.10 mg/L),四种酵母产生的醛酮类物质含量相差不大。其中,四种酵母均可产生乙醛,而且对醛酮类化合物总量起决定性作用。酿酒酵母通常比非酿酒酵母产生的乙醛多[28],不同葡萄汁有孢汉逊酵母菌株的产乙醛能力不同,平均产量约是25 mg/L[11]。本实验中,乙醛产量最高的是美极梅奇酵母(3.35 mg/L),含量最少的是葡萄汁有孢汉逊酵母(2.00 mg/L)。

2.2.5 萜烯类化合物 已经发现从葡萄酒酿造中分离的酿酒酵母具有从头合成单萜烯的能力[29]。微生物合成萜烯类化合物是通过二磷酸异戊烯(IPP)生物合成途径合成的[30-32]。IPP之间结合形成香叶基二磷酸、法呢基二磷酸、香叶基香叶基二磷酸,分别是形成单萜、倍半萜和二萜的前驱物。其他萜烯类化合物来源于这三个前驱物的环化或二次修饰。由于萜烯类化合物的香气阈值低,所以少量的萜烯对葡萄酒香气的影响也非常大。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到8种萜烯类化合物,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生6、5、4、7种萜烯类化合物。由DV10产生的萜烯类含量最高,含量为0.79 mg/L,其中含量较高的包括里那醇、香茅醇、香叶醇;浅白隐球酵母产生的萜烯类含量为0.70 mg/L,含量较高的萜烯类为香茅醇、香叶醇和金合欢醇;葡萄汁有孢汉逊酵母产生的萜烯类含量为0.42 mg/L,含量较高的为香茅醇、香叶醇;产萜烯类最少的为美极梅奇酵母,含量为0.32 mg/L,含量较高的为香茅醇。通常对葡萄酒萜烯类化合物的研究是从酵母分泌糖苷酶将葡萄浆果中的糖苷中释放萜烯类化合物的角度进行的,本实验结果表明酵母通过自身生物合成萜烯类化合物,并且不同酵母产生的萜烯类化合物的种类和含量不同。

2.2.6 苯环类化合物 苯丙氨酸为底物,可以生产多种芳香族化合物。苯乙醇由原料中的苯丙氨酸脱氨基与脱羧基而生成[33]。苯甲醇具有温和的甜香、水果香、花香和柑橘香[34-35]。苯乙醇具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[36]。低浓度的苯甲醛具有水果香、花香、类似杏仁香[37-38,34];苯乙醛有蜂蜜香、花香、玫瑰花香和甜香[39];苯甲酸能释放出水果香和樱桃香;苯乙酸呈水果香和玫瑰花香[37-38]。由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到6种苯环类化合物,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生4、4、4、5种苯环类化合物。苯环类化合物含量由高到低为美极梅奇酵母(102.68 mg/L)、浅白隐球酵母(44.92 mg/L)、葡萄汁有孢汉逊酵母(39.54 mg/L)、DV10(33.33 mg/L),表明了四种酵母产苯环类化合物能力的高低。其中,苯乙醇是四种酵母都产生的,而且对苯环类化合物总量起决定性作用。苯乙醇产量最高的是美极梅奇酵母(102.49 mg/L),这与Clemente-Jiménez等[40]的研究结果一致,高产苯乙醇是美极梅奇酵母的特点;其次是浅白隐球酵母(44.22 mg/L);含量最少的是DV10(32.70 mg/L)。

2.2.7 其他成分 由表1可知,不同酵母发酵模拟葡萄汁培养基共检测到4种其他香气成分,其中浅白隐球酵母、美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和酿酒酵母DV10各产生3、1、2、3种其他化合物。其他化合物含量由高到低为浅白隐球酵母(1.89 mg/L)、DV10(1.73 mg/L)、葡萄汁有孢汉逊酵母(0.96 mg/L)、美极梅奇酵母(0.30 mg/L)。

2.3 不同酵母主要发酵香气的OAV值

OAV可用于评价各风味化合物对酒香气的贡献,Allen等[41]研究发现OAV大于1的化合物对酒风味有贡献。不同酵母发酵产生的挥发性化合物的OAV如表2所示。

由表2可以看出,共有17种挥发性化合物的OAV大于1,以酯类和萜烯类为主。其中,3-甲基丁醇是唯一一种超过阈值的醇类物质,带来苦杏仁味和涩味。己酸和辛酸是OAV值大于1的两种有机酸,其中辛酸在4个酵母中都能产生,尤其是葡萄汁有孢汉逊酵母中最高,给葡萄酒带来奶酪味和脂肪味。OAV大于1的几种酯类,包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯,在葡萄汁有孢汉逊酵母和DV10中有较高的值。乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯和乙酸-2-苯乙酯在葡萄汁有孢汉逊酵母中的OAV值最大,分别为1.17、39.00、43.12、2.40、57.44,说明这个菌株发酵的酒中果香和花香比较好。丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯在DV10中的OAV值最大,分别为4.00、159.29、120.30、4.40,说明这个菌株发酵的酒中果香浓郁。DV10的里那醇OAV值最大(6.40),这种成分给酒带来柑橘香和甜香。4个菌株产生的香茅醇、香叶醇和金合欢醇三种萜烯类化合物的OAV值都大于1,香茅醇最高的是葡萄汁有孢汉逊酵母(2.10),给酒带来青草味和丁香花香;香叶醇最高的是DV10(6.33),给酒带来热带水果和青草味;金合欢醇最高的是浅白隐球酵母(6.50),有柔和的甜香气。4个菌株产生的苯乙醇的OAV值在4.52～14.18,最高的是葡萄汁有孢汉逊酵母,赋予酒体以玫瑰花香。这些主要香气物质融合成为协调细腻的香气,给人以愉悦、柔和优雅的感觉,对葡萄酒的香气有非常重要的贡献。

2.4 不同酵母主要发酵香气的主成分分析

为揭示不同酵母产生的发酵香气之间的主要差异,以OAV大于1的17种香气物质定量数据作图,前2 个主成分PC1和PC2的累计贡献率占总变量的88.09%,其中,PC1解释了56.63%的变量,PC2解释了31.46%的变量,如图3、图4所示。

由图3、图4可以看出,不同酵母的发酵香气差别很明显,DV10、浅白隐球酵母和美极梅奇酵母主要分布在PC1上;DV10最重要的发酵香气为丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸、里那醇和香叶醇;浅白隐球酵母最重要的发酵香气为金合欢醇;美极梅奇酵母最重要的发酵香气为3-甲基丁醇和苯乙醇。葡萄汁有孢汉逊酵母分布在PC2正向上,最重要的发酵香气为乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、辛酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸和香茅醇。

图3 不同酵母在前两个主成分上的分布图Fig.3 Distribution of different yeasts in the first two components of the PCA

3 结论

本实验通过对葡萄汁有孢汉逊酵母、浅白隐球酵母和美极梅奇酵母这三株非酿酒酵母的生长特性和发酵香气进行比较分析,发现不同非酿酒酵母之间的生长能力和产生的发酵香气有显著区别。香气物质总含量由高到低为美极梅奇酵母(206.27 mg/L)、葡萄汁有孢汉逊酵母(141.64 mg/L)、浅白隐球酵母(137.78 mg/L)、DV10(123.81 mg/L)。美极梅奇酵母的适应能力较好,在发酵前期比较活跃,但一般很难独立完成发酵,必须与酿酒酵母相结合使用。浅白隐球酵母的生长和适应能力较差,一般在发酵中后期发挥作用,也必须与酿酒酵母相结合使用。葡萄汁有孢汉逊酵母在具有良好生长和适应能力的同时,产生的香气物质种类最多。本实验结果表明3株非酿酒酵母在葡萄酒酿造中具有丰富产品风味和提高产品香气质量的优良特性,可以与酿酒酵母混合发酵,生产具有特定风味的葡萄酒,具有一定的工业开发潜力。

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