响应面法优化蚕豆多酚 超声辅助提取工艺

钱 敏,李春阳,*,刘玉皎,王 帆,陈 新,吴 寒

(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014;3.青海省农林科学院,青海西宁 810000;4.江苏省农业科学院经济作物研究所,江苏南京 210014)

蚕豆在我国已有二千年栽培史[1],是我国目前种植面积和产量位居第三的食用豆类作物,仅次于大豆和花生[2],分别占世界蚕豆种植面积和总产量的53.8%和64.1%[3]。中医认为蚕豆的花、果实、种壳,及叶均可入药,有止血,利尿解毒,消肿之功效,并且国外已有用蚕豆提取抗癌物质的报道[4]。有研究证明蚕豆中含有丰富的酚类化合物,具有降低小鼠心血管疾病的风险,可作为很好的天然抗氧化食物和功能食物的来源[5]。

目前,国内对豆类酚类物质研究较多,主要是比较不同品种豆类多酚含量及其抗氧化活性[6-8],李思荻等[7]研究发现,合丰大豆和白芸豆对羟基自由基的清除能力强于其他豆类,提取液中的多酚含量与其抗氧化性成正相关关系。国外对于蚕豆多酚的研究主要集中在其抗氧化活性[9-11]及酚类物质组成成分分析[12-14],Marathe等[9]研究表明,表皮颜色较深的杂豆抗氧化性较强,且抗氧化性强弱与豆中所含酚类物质有关,Journi等[12]从蚕豆多酚中鉴定出槲皮素糖苷、表儿茶素糖苷等五种成分,Merghem等[13]利用电子喷雾质谱及高效液相色谱技术从蚕豆原花青素中分离鉴定出原花青素二聚物B1、B2和B3及原花青素三聚物等六种主要化合物。

由于超声提取具有操作简单方便、提取率高、提取温度低、不破环提取物结构等特点,已广泛用于提取天然植物有效成分,如橙皮多酚的提取[15]、海棠叶中总黄酮的提取[16]、茶多酚的提取[17]、猕猴桃根熊果酸的提取[18]、大豆异黄酮的提取[19]等。目前有关蚕豆多酚的提取主要还是溶剂浸提法,关于超声波辅助提取蚕豆多酚工艺优化的报道尚不多见。因此本文将系统优化蚕豆多酚超声提取工艺,并在已有报道的基础上考虑了提取液的pH对多酚提取量的影响,以期获得适宜的提取方法,为将来工业化高效提取蚕豆中酚类物质提供参考,以便进行蚕豆的保健品开发和蚕豆抗氧化剂制品的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苏蚕三号 由江苏省农业科学院蔬菜所提供;甲醇、乙醇、丙酮、无水碳酸钠 均为国产分析纯;没食子酸标准品与Folin-Ciocalteu试剂 购自Sigma公司。

AL104型电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Sigma 3K15离心机 德国Sigma公司;RE-5203旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;万能高速粉碎机 欧凯莱芙(香港)宝业公司;PHS-2C型数显pH计 上海智光仪器仪表公司;752S型紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的制作 配制浓度为1 mg/mL的没食子酸标准溶液,分别吸取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00 mL于100 mL容量瓶中定容,得10、20、30、40、50、100 μg/mL的没食子酸标准溶液,移取1 mL没食子酸标准溶液于试管中,加入5 mL蒸馏水,1 mL 10%福林酚,反应3 min后加3 mL 7.5% Na2CO3,室温下放置2 h,于765 nm处测吸光值[20]。以浓度(X)对吸光度(Y)进行线性回归分析,绘制出没食子酸标准曲线。

求得回归方程为Y=0.0088X+0.0558(0～100 μg/mL,R2=0.9996),其中X为没食子酸浓度,单位为μg/mL,Y为吸光度。

1.2.2 蚕豆多酚的提取及含量测定 将蚕豆冷冻干燥(-20 ℃预冻6 h,-80 ℃冷冻20 h,放入冻干机中,在冷阱温度为-45 ℃,真空度为13.3 Pa、加热隔板温度为30 ℃左右冷冻干燥24 h),用万能粉碎机将蚕豆粉碎,过60目筛,制得蚕豆粉(水分含量2.98%±0.06%,w/w),-20 ℃保存备用。准确称取1 g蚕豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)加入60%乙醇溶液进行超声提取,超声功率300 W,超声温度35 ℃,提取20 min后4500 r/min离心10 min,收集上清液,残渣用同样的方法再次提取,合并两次上清液,45 ℃减压旋转蒸干,甲醇定容至10 mL,-20 ℃避光储存,用于多酚含量的测定。多酚提取量以每克提取物(干基)中所含相当于没食子酸的量mg表示。

式中:C为测量液总酚浓度(μg/mL);V为提取液的总体积(mL);N为稀释倍数;M为样品除去水分质量(g);1000为质量转化单位(mg/μg)。

1.2.3 提取剂种类的选择 准确称取1 g蚕豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)的比例分别加入体积分数均为60%的甲醇、乙醇、丙酮,用1 mol/L HCl调节至pH4(下文同),在300 W、35 ℃下超声提取20 min,提取两次,研究不同提取剂种类对蚕豆多酚提取效果的影响。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 乙醇体积分数对提取效果的影响 准确称取1 g蚕豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)分别加入pH4,不同浓度的乙醇水溶液(20%、40%、60%、80%、100%),300 W、35 ℃下超声提取20 min,提取两次,研究乙醇体积分数对蚕豆多酚提取效果的影响。

1.2.4.2 料液比对提取效果的影响 准确称取1 g蚕豆粉,分别加入10、15、20、25、30 mL体积分数为60%、pH4的乙醇水溶液,300 W、35 ℃下超声提取20 min,提取两次,研究料液比对蚕豆多酚提取效果的影响。

1.2.4.3 提取时间对提取效果的影响 准确称取1 g蚕豆粉5份,分别加入15 mL体积分数为60%、pH4的乙醇溶液。300 W、35 ℃下超声提取10、15、20、25、30 min,提取两次,研究提取时间对蚕豆多酚提取效果的影响。

1.2.4.4 提取液pH对提取效果的影响 准确称取1 g蚕豆粉,分别加入15 mL体积分数为60%不同pH3、4、5、6、7、8、9的乙醇溶液,300 W、35 ℃下超声提取20 min,提取两次,研究pH对蚕豆多酚提取效果的影响。

1.2.5 响应面实验设计 根据Box-Benhnken中心组合设计原则,以乙醇体积分数、料液比、提取时间、pH四个因素为自变量,多酚提取量为响应值,设计了四因素三水平的响应面分析实验,各因素水平见表1。

表1 Box-Benhnken响应面实验因子与水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3 数据处理

所有实验均重复三次,实验数据以平均值±标准差(Means±SD)表示,采用Excel 2003软件作图,使用SAS 9.3 软件对数据结果进行处理分析,设置显著水平为p<0.05,极显著水平为p<0.01。中心组合实验数据处理使用Design Expert 8.0.6软件进行。

2 结果与分析

2.1 提取剂种类对提取效果的影响

从图1可以看出,60%不同提取剂的提取效果依次为:乙醇>甲醇>丙酮,且乙醇的成本较低、环境友好,所以本文选择乙醇作为提取溶剂。在杨希鹃等[21]的蚕豆多酚提取实验中,60%甲醇的提取率高于60%乙醇,这可能是因为不同品种蚕豆中的酚类物质组成不同,导致极性不同,对甲醇和乙醇的亲和性不同,从而导致最佳提取溶剂种类有差异。

图1 提取剂种类对多酚提取量的影响Fig.1 The influence of the type of extracting solution on extraction volume

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 乙醇体积分数对提取效果的影响 由图2可以看出,随着乙醇浓度增大,多酚提取量呈现先增加后降低的趋势,当乙醇浓度达到40%时,提取量最大。分析原因可能是蚕豆中多酚与多糖、蛋白质等以氢键和疏水键形成稳定的化合物,随着乙醇浓度升高,对氢键断裂作用越强,多酚提取量升高[22]。然而,当乙醇浓度超过40%时,多酚提取量下降,根据相似相溶原理推测可能是由于溶剂与多酚极性差异增大,多酚类物质得不到充分溶解,提取量反而下降。本文中多酚提取量随乙醇体积分数的变化趋势与王文昕等[23]的响应面法优化花生红衣多酚提取的报道是相符的。因此本文选择乙醇体积分数为40%。

图2 乙醇体积分数对多酚提取量的影响Fig.2 The influence of the concentration of the extracting solution on extraction volume

2.2.2 料液比对提取效果的影响 由图3可以看出,当料液比小于1∶25 (g/mL)时,随料液比增大,蚕豆多酚提取量增大,这可能是因为,蚕豆组织中多酚与蛋白质、生物碱、多糖等以氢键等形式结合在一起,阻碍多酚类物质的提取,而有机溶剂和水的混合液能有效的抑制这种结合,因此提取液增大有利于蚕豆多酚的提取。但当料液比达到1∶25 (g/mL)以后,再增大溶剂的用量,多酚提取量下降,而且溶剂用量太大,会使热负荷增大,提取完全所需要的时间增大[24]。在郭彩霞等[25]的响应面优化超声波辅助提取猕猴桃果皮多酚实验中也观察到类似现象。因此本文选择的料液比为1∶25 (g/mL)。

图3 料液比对提取量的影响Fig.3 The influence of the solid-liquid ratio on extraction volume

2.2.3 提取时间对提取效果的影响 由图4可以看出,当提取时间从5 min增加到20 min时,多酚提取量由1.31 mg/g d.w.增加至1.74 mg/g d.w.。这可能是因为超声波提取能加速介质质点运动,同时产生空化作用,使提取物质加速浸出[26],当超声时间大于20 min时,多酚提取量呈下降趋势,这可能与超声的时间过长,产生热效应使温度升高,从而使得多酚类物质结构被破环有关[27]。在Yang等[28]的响应面法优化余甘子树皮多酚及Sun等[29]的响应面法优化苦丁茶中酚类物质提取的实验中也观察到类似现象。因此,选择超声提取时间为20 min。

图4 提取时间对多酚提取量的影响Fig.4 The influence of the extracting time on extraction volume

2.2.4 提取液pH对提取效果的影响 由图5可以看出,不同的pH对提取效果有显著的影响,当pH为5时,多酚提取量最大。这可能是由于在酸性条件下多酚与酸形成佯盐,以离子形式存在,容易析出;而且在酸性条件下多酚氧化酶的活性受到抑制,从而抑制了多酚在提取过程中的酶促氧化,进而提高了多酚的提取率。与赵谋明等[30]报道的多酚提取量随pH变化趋势相符。因此本文选择pH5为适宜pH。

图5 提取液pH对多酚提取量的影响Fig.5 The influence of the pH on extraction volume

2.3 响应面优化实验

2.3.1 二次响应面回归模型的建立与分析 响应面设计与结果见表2。应用Design Expert 进行回归拟合分析,得到提取条件与多酚提取量之间的二次多项式模型为:

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Response surface experimental design and results

Y=2.17-(9.167E-003)A-0.028B+0.064C-0.026D-0.057AB-0.053AC-0.057AD-0.013BC+(2.500E-003)BD+0.047CD-0.13A2-0.19B2-0.22C2-0.20D2。

表3 回归方程系数显著性检验表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

2.3.2 两因子间交互作用分析 响应面分析图见图6～图11。

由图6可知,当料液比一定时,随着乙醇体积分数的增大,提取量先增大后减小;当乙醇体积分数一定时,随料液比的变化,提取量也呈先增大后减小趋势,且响应面坡度较陡峭,说明乙醇体积分数和料液比的交互作用极显著。

图6 乙醇体积分数和料液比及其相互作用对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and solid-liquid ratio

图7表示pH为5、料液比为1∶25 (g/mL)时乙醇体积分数和时间对蚕豆多酚提取量的影响。当时间一定时,随乙醇体积分数变化,多酚提取量变化不明显,趋势较平缓;当乙醇体积分数一定时,随时间变化,提取量先增后减,且弧度较陡,说明时间的主效应大于乙醇体积分数。

图7 乙醇体积分数和时间及其相互作用对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and extracting time

图8表示当料液比为1∶25 (g/mL)、提取时间为20 min时,乙醇体积分数和pH对蚕豆多酚提取量的影响。当pH一定时,随乙醇体积分数的变化,提取量先增后减,趋势较平缓;当乙醇体积分数一定时,随pH变化,提取量先增大后减小,幅度较陡峭,说明pH的主效应大于乙醇体积分数,又等高线图呈椭圆形,说明两者间交互作用显著。

图8 乙醇体积分数和pH及其相互作用对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and pH

图9表示当乙醇体积分数为45%、pH为5时,料液比和时间对蚕豆多酚提取量的影响。当时间一定时,随料液比的增大,蚕豆提取量先增大后减小;当料液比一定时,随时间变化,料液比先增后减。由等高线为圆形,可知两者交互作用不显著。

图9 料液比和时间及其相互作用对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and extracting time

图10表示乙醇体积分数为45%、提取时间为20 min时,料液比和pH对蚕豆多酚提取量的影响。当pH一定时,随料液比升高,提取量先增后减;当料液比一定时,随pH变化,提取量先升高后降低。由其等高线呈圆形,可知两者交互作用不显著。

图10 料液比和pH及其相互作用 对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.10 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and pH

图11表示乙醇体积分数为45%、料液比为1∶25 (g/mL)时,时间和pH对蚕豆多酚提取量的影响。当pH一定时,随时间升高,提取量先增后减;当时间一定时,随pH变化,提取量先升高后降低。

图11 时间和pH及其相互作用 对蚕豆多酚提取量影响的响应面和等高线图Fig.11 Response surface and contour plots for extraction volume under extracting time and pH

2.3.3 最佳条件的预测及验证实验 通过响应面优化得到超声波提取蚕豆多酚的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数44.71%、料液比1∶23.89 (g/mL)、时间20.09 min、pH4.8,此时蚕豆多酚提取量达到最大值(2.06±0.23) mg/g d.w.。为方便实际操作,各条件调整为:乙醇体积分数45%、料液比1∶25 (g/mL)、时间20 min、pH5,在此条件下进行验证,测得蚕豆多酚提取量为(2.03±0.16) mg/g d.w.,与预测值(2.06±0.23) mg/g d.w.误差值为1%,证实了该模型的有效性。本实验多酚提取量与杨希鹃等[21]在正交优化条件甲醇体积分数60%,料液比1∶15 (g∶mL),超声波功率300 W 的条件下提取 20 min,得到的蚕豆多酚提取量47.78 mg/100 g d.w.相比较高,推测可能是因为本实验考虑了提取溶剂的pH,有机酸的添加促进了结合酚的释放,从而提高了总酚的含量;该值与巩蔼[8]报道的用60%乙醇溶液水浴浸提3 h得到的蚕豆多酚含量值0.25%相近,但与Siah[31]用70%丙酮提取得到的多酚提取量6.2～10.7 mg/g d.w.、赵艳等[6]用70%丙酮(丙酮∶水∶乙酸=70∶29.5∶0.5,V/V/V)在25 ℃下振荡3 h得到的总酚提取量5.80～8.37 mg/g d.w.实验值相比还是较低,结果的差异可能与蚕豆品种、生长环境、栽培条件以及实验方法等的不同都有很大关系。

3 结论

本实验采用单因素实验及响应面Box-Benhnken实验设计,对超声辅助提取蚕豆多酚工艺进行优化,得到的最佳工艺条件为:乙醇体积分数45%、料液比1∶25 (g/mL)、提取时间20 min、pH5,在此条件下蚕豆多酚提取量为(2.03±0.16) mg/g d.w.,与预测值(2.06±0.23) mg/g d.w.高度相符,模型可靠。

[1]游修龄. 蚕豆的起源和传播问题[J]. 自然科学史研究,1993,12(2):166-167.

[2]Xiaohong T H T B T,Ming L. Chemicophysical properties of twenty broad bean varieties and their correlations[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2009,24(12):153-157.

[3]Tian X H,Tan H Z,Tan B,et al. Analyse physicochemical properties of broad beans in main producing areas in China[J]. Science and Technology of Cereals Oils and Foods,2009,17(2):7-12.

[4]李雪琴,裘爱泳. 蚕豆生理活性物质研究进展[J]. 粮食与油脂,2002(7):34-35.

[5]Macarulla M T,Medina C,De Diego M A,et al. Effects of the whole seed and a protein isolate of faba bean(Viciafaba)on the cholesterol metabolism of hypercholesterolaemic rats[J]. British Journal of Nutrition,2001,85(5):607-614.

[6]赵艳,杜双奎,王晗欣,等. 5 种杂豆体外抗氧化性研究[J].中国粮油学报,2015,30(10):6-10.

[7]李思荻,赵永焕. 东北几种豆类提取物的体外抗氧化活性研究[J]. 粮油加工,2010(4):54-57.

[8]巩蔼,任顺成,常云彩,等. 云南特色豆类的酚类含量及其抗氧化活性[J]. 中国粮油学报,2015,30(4):1-5.

[9]Marathe S A,Rajalakshmi V,Jamdar S N,et al. Comparative study on antioxidant activity of different varieties of commonly consumed legumes in India[J]. Food and chemical toxicology,2011,49(9):2005-2012.

[10]Turco I,Bacchetti T,Bender C,et al. Polyphenol content and glycemic load of pasta enriched with Faba bean flour[J]. Functional Foods in Health and Disease,2016,6(5):291-305.

[11]Okumura K,Hosoya T,Kawarazaki K,et al. Antioxidant activity of phenolic compounds from fava bean sprouts[J]. Journal of Food Science,2016,81(6):C1394-C1398.

[12]Journi M,Hammouda H,Trabelsi-Ayadi M,et al. Quantitative determination and identification of phenolic compounds of three Tunisian legumes:Viciafaba,LensculinarisandPhaseolusvulgaris[J]. Chemistry and Biochemistry Sciences,2015,2(3):1-12.

[13]Merghem R,Jay M,Brun N,et al. Qualitative analysis and HPLC isolation and identification of procyanidins fromViciafaba[J]. Phytochemical Analysis,2004,15(2):95-99.

[14]Baginsky C,Pea-Neira á,Cáceres A,et al. Phenolic compound composition in immature seeds of fava bean(ViciafabaL.)varieties cultivated in Chile[J]. Journal of food composition and analysis,2013,31(1):1-6.

[15]Khan M K,Abert-Vian M,Fabiano-Tixier A S,et al.

Ultrasound-assisted extraction of polyphenols(flavanone glycosides)from orange(CitrussinensisL.)peel[J]. Food Chemistry,2010,119(2):851-858.

[16]乔孟,屈晓清,丁之恩. 响应面法优化超声波辅助提取湖北海棠叶中总黄酮工艺[J]. 食品科学,2013,34(2):143-147.

[17]Guo S Q,Sheng-Ju W U,Dai L I. Optimization of ultrasonic extraction of tea polyphenols from green tea by response surface methodology[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering,2009,7(1):39-43.

[18]杨艳,任亚梅,马婷,等. 响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺[J]. 食品科学,2014,35(4):44-49.

[19]Rostagno M A,Palma M,Barroso C G. Ultrasound-assisted extraction of soy isoflavones[J]. Journal of Chromatography A,2003,1012(2):119-128.

[20]张清安,范学辉,张志琪,等. 沙苑子提取物中多酚含量的测定[J]. 食品科学,2010,31(14):178-181.

[21]杨希娟. 青海蚕豆多酚的提取工艺优化及不同品种(系)酚类含量及抗氧化活性[J]. 食品与发酵工业,2016,42(11):237-243.

[22]孙晓雪. 甘蔗梢中酚类物质的提取与应用研究[D]. 南宁:广西大学,2007.

[23]王文昕,董全. 响应面法优化超声辅助提取花生红衣多酚工艺[J]. 食品科学,2012,33(22):1-5.

[24]郭新竹,宁正祥. 天然酚类化合物及其保健作用[J]. 食品工业,2002,23(3):28-29.

[25]郭彩霞,任晓婷,张生万,等. 响应面法优化超声波辅助提取猕猴桃果皮多酚工艺研究[J]. 食品工业科技,2017(11):38.

[26]吴棉国,林彦铨. 大力推进甘蔗标准化体系建设的对策及建议[J]. 中国农学通报,2011,27(1):456-460.

[27]郑利琴. 杨梅多酚提取及应用研究[D]. 无锡:江南大学,2011.

[28]Yang L,Jiang J G,Li W F,et al. Optimum extraction process of polyphenols from the bark ofPhyllanthusemblicaL. based on the response surface methodology[J]. Journal of Separation Science,2009,32(9):1437.

[29]Sun Y,Xu W,Zhang W,et al. Optimizing the extraction of phenolic antioxidants from kudingcha made from Ilex kudingcha C.J. Tseng by using response surface methodology[J]. Separation & Purification Technology,2011,78(3):311-320.

[30]赵谋明,刘晓丽,崔春,等. 余甘子多酚响应面法优化提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技,2007,28(6):117-120.

[31]Siah S,Konczak I,Wood J A,et al. Effects of roasting on phenolic composition andinvitroantioxidant capacity of Australian grown faba beans(ViciafabaL.)[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2014,69(1):85-91.

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