灵芝发酵粉中三萜化合物提取与测定

胡琼方，董建生，高文庚

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；2.山西瑞芝生物科技有限公司，山西运城 044000；3.运城学院生命科学系，山西运城044000）

灵芝（Ganoderma lucidum）别名赤芝、丹芝，灵芝属真菌，其作为药用已有两千多年历史，在《本草纲目》和《神农本草经》中均有记载。现代研究证实，灵芝中含有多种活性成分，包括多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、氨基酸蛋白类等，其中多糖和三萜类是灵芝药效的主要物质基础[1]。

灵芝三萜类化合物具有抑菌、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗HIV和抑制HIV-1蛋白酶活性、抗炎症的作用[2-11]，其提取方法多种，包括回流浸提法、微波法、超声波法、超临界CO2提取法[12-16]，其中超声波技术提取率高、操作简单，适用于工厂进行在线检测。灵芝发酵粉以谷物为基质发酵精制而成，产品中残留的糖类物质会影响功能性多糖测定，故探索产品中三萜化合物含量的测定方法，为进一步控制灵芝发酵产品质量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV754N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL6M低速离心机：上海百典仪器设备有限公司；KQ-300GDV数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FW100微型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。

灵芝发酵粉：山西瑞芝生物科技有限公司提供，是以谷物为发酵基质，接入灵芝液体菌种经固态发酵后精制而成。齐墩果酸标准品：安徽酷耳生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

参照陈飞等[17]的方法，以齐墩果酸标准品，于470 nm～800 nm处测定吸光度，发现在555 nm处测得的吸光度值最高，制得的标准曲线回归方程为y=57.516X-0.011 4，R2=0.999 3。

1.2.2 灵芝发酵粉中三萜化合物的提取与测定

精确称取样品2.000 0 g，用95%乙醇80 mL浸泡100 min后，180 W、60℃超声提取30 min，取出放冷，20℃下4 000 rpm离心10 min，留上清液减压浓缩至5 mL，取1.00 mL到试管中，分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.30 mL、高氯酸1.00 mL，70℃水浴25 min，冷水浴中冷却，超声波辅助提取灵芝三萜化合物得率的影响，采用响应面Box-Behnken进行工艺优化，确定最佳提取条件。响应面试验因素水平表见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对灵芝发酵粉中三萜化合物得率的影响

不同乙醇浓度对灵芝发酵粉中三萜化合物得率的影响情况见图1。

图1 乙醇浓度对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

采用超声波辅助提取灵芝发酵粉中三萜化合物，提取溶剂选取乙醇，分别选择55%、65%、75%、85%、95%和无水乙醇进行试验。由图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，三萜类化合物得率呈现先上升后下降的趋势，其中95%乙醇提取得率最高。经单因素方差分析发现。乙醇浓度对灵芝发酵粉三萜化合物的提取得率是有极显著影响（p<0.01），因此本试验采用95%乙醇进行提取。

2.2 浸泡时间对灵芝发酵粉中三萜得率的影响

浸提前期，乙醇浸泡时间对灵芝发酵粉中三萜得率的影响见图2。

图2 浸泡时间对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.2 Effect of soaking time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由图2可以看出，当浸泡时间为100 min时，其三萜得率最高，为0.553 6 mg/g。低于100 min，灵芝三萜得率随着浸泡时间的延长而升高，超过100 min则会逐渐下降。经单因素方差分析得到（p<0.01），说明不同浸泡时间对灵芝发酵粉三萜化合物的提取得率是有极显著影响的，因此，试验采用浸泡时间为100 min。

2.3 料液比对灵芝发酵粉中三萜得率的影响

浸提时的料液比对灵芝发酵粉中三萜得率的影响见图3。

图3 料液比对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.3 Effect of liqud to liquid ratio on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由图3可知，三萜得率随料液比的增加而升高，当料液比高于1∶40（g/mL）时，三萜得率出现下降趋势，其原因可能为一定量的灵芝发酵粉中所加入提取剂过少时不利于三萜类化合物的溶出，当加入的提取剂不断增加时，使得三萜化合物全部溶出。通过单因素方差分析得出（p<0.01），说明不同的料液比对灵芝发酵粉三萜化合物得率是有极显著影响，当料液比为1 ∶40（g/mL）时，三萜含量达到最高值 0.551 4 mg/g，故选择料液比为 1 ∶40（g/mL）。

2.4 超声功率对灵芝发酵粉三萜得率的影响

不同超声功率对灵芝发酵粉三萜的得率有一定影响，其结果见图4。

图4 超声功率对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由图4可知，随着超声功率的不断增加，三萜得率呈现先上升后下降的趋势，当超声功率为210 W时，三萜得率达到最高值0.592 9 mg/g。经方差分析，超声功率为210 W时三萜得率显著高于其他水平（p<0.05），故试验选择超声功率为210 W。

2.5 超声时间对灵芝发酵粉中三萜得率的影响

超声处理的时间不同，对灵芝发酵粉中三萜得率的影响不同，测定结果见图5。

图5 超声时间对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由图5可以看出，随着超声时间的不断增加，灵芝发酵粉三萜得率呈现先上升后下降的趋势，当超声时间为20 min时，三萜得率达到最高值，超过20 min三萜得率在逐渐下降。经差异性显著分析，超声处理时间对三萜得率的影响显著（p<0.01）故选择提取时间为20 min。

2.6 超声温度对灵芝发酵粉三萜得率的影响

超声处理的温度对灵芝发酵粉中三萜化合物的提取也有一定的影响，其结果见图6。

图6 超声温度对灵芝发酵粉三萜得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由图6可知，灵芝发酵粉三萜得率在超声温度为40℃时达到最大值，超过40℃时，三萜得率在明显下降，表明在一定温度范围内，温度越高越有利于灵芝发酵粉中三萜化合物的溶出，当温度过高时，不利于三萜化合物的溶出，使提取得率降低。经单因素方差分析可知（p<0.05），不同的超声温度下，三萜化合物的提取得率是有显著差异的，说明超声温度对三萜得率是有显著性影响的。因此超声温度选择40℃。

2.7 响应面试验结果

为了进一步考察各因素对灵芝发酵粉中三萜化合物提取得率的影响，在单因素试验基础上，选取料液比、超声温度、超声时间、超声功率作为考察因素，根据Box-Behnken试验设计原理，以灵芝发酵粉三萜得率作为响应值，采用四因素三水平进行响应面试验，结果见表2。

表2 响应面设计及结果Table 2 Response surface design and results

2.7.1 模拟的建立及其显著性检验

运用Design-Expert软件对表2的试验数据进行二次模拟回归分析，以三萜得率为因变量，料液比、超声温度、超声时间、超声功率为自变量的二次多项回归方程：

三萜得率＝0.58 ＋0.026A －4.717 ×10-3B －0.022C ＋0.022D＋0.036AB－0.022AC－2.750×10-4AD－0.041BC－2.750 ×10-4BD ＋0.018CD －0.086A2－0.044B2－0.063C2－0.10D2，二次多项回归分析结果见表3

表3 回归方程的方差分析结果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，模型p＜0.000 1，达到极显著水平，失拟项p=0.487 4＞0.05，表示不显著；即该模型对本试验的拟合程度良好，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。其中R2=0.968 5，表明自变量和响应值之间的关系显著，调整系数R2Adj=0.937 0，说明该模型能够解释93.70%的响应值变化，试验误差小，可以运用此模型对灵芝发酵粉三萜化合物提取进行分析和预测。一次项 A、C、D（p＜0.01）和二次项 A2、B2、C2、D2（p＜0.000 1），说明对响应值即灵芝发酵粉三萜得率的影响达到极显著水平，AB、BC（p＜0.01），说明 A（料液比）与B（超声温度），B（超声温度）与C（超声时间）交互作用极显著，AC（p＜0.05）说明 A（料液比）与 C（超声时间）交互作用显著，说明各种试验因子对因变量的影响不是简单的线性关系。

2.7.2 响应面交互作用分析

为确定料液比、超声温度、超声时间、超声功率及其两两交互作用对灵芝发酵粉三萜化合物提取得率的影响，根据二次模拟回归方程绘出响应面及等高线图（图7～图12）。

图7 料液比和超声温度对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.7 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

图8 料液比和超声时间对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.8 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

图9 料液比和超声功率对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.9 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[18]。

图10 超声温度和超声时间对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.10 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

图11 超声温度和超声功率对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.11 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powde

图12 超声时间和超声功率对灵芝发酵粉三萜得率交互影响的三维曲面图Fig.12 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

由图7～图12可以看出，有3个三维曲面图为椭圆形，3个三维曲面图为圆形，表明料液比和超声温度、料液比和超声时间、超声温度和超声时间的交互作用显著，而料液比和超声功率、超声温度和超声功率、超声时间和超声功率交互作用不显著。

2.7.3 最佳提取条件确定

利用Design-Expert软件分析，得出灵芝发酵粉三萜化合物提取的最佳条件为：料液比=1∶42.53（g/mL），超声温度为42.97℃，超声时间为16.99 min，超声功率212.45 W，为便于试验操作，调整条件为料液比=1∶42（g/mL）、超声温度 43 ℃、超声时间 17 min、超声功率210 W。重复3次验证，三萜类化合物的平均得率为0.612 8 mg/g。

3 结论

影响超声波法辅助提取三萜化合物的因素较多，试验仅针对主要影响因素进行研究，在单因素试验基础上，确定浸提溶剂为95%乙醇，提前浸泡100 min，并运用Box-Behnken试验设计对超声波辅助提取工艺进行优化，得到最佳工艺参数为：料液比1∶42（g/mL）、超声温度43℃、超声时间17 min、超声功率210 W，所得灵芝三萜类化合物的得率为0.612 8 mg/g。采用超声波提取灵芝发酵粉中三萜化合物，不仅为产品质量检验提供的基础，同时对活性物质的提取提供了指导作用。

[1]高文庚,尚楠,樊明涛,等.灵芝发酵粉基质优化及其营养成分分析[J].中国农业大学学报,2011,16(1):88-93

[2]王明蛟,高航,刚婉娇.灵芝化学成分分析方法的研究[J].长春中医药大学学报,2014,30(5):817-819

[3]Liu RM,Zhong JJ.Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Phytomedicine,2011,18(5):349-355

[4]王晓玲,刘高强,周国英.紫芝发酵菌体中三萜类化合物的抑菌活性研究[J].时珍国医国药,2008,19(11):2636-2637

[5]Shwu Bin Lin,Chyi Hann Li,Shiuh Sheng Lee,et al.Triterpene-enriched extracts from Ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase C,activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest[J].Life Sciences,2003,72(21):2381-2390

[6]刘峰,李鹏,黄秀旺,等.灵芝三萜组分GLE体内外抗肿瘤作用[J].中国新药杂志,2012(23):2790-2793

[7]Yue QX,Xie FB,Guan SH,et al.Interaction of Ganoderma triterpenes with doxorubicin and proteomic characterization of the possible molecular targets of Ganoderma triterpenes[J].Cancer Science,2010,99(7):1461-1470

[8]刘莉莹,王洪庆,刘超,等.树灵芝中三萜类成分及其保肝作用研究[J].天然产物研究与开发,2017(4):584-589

[9]刘晓珍,聂少平,李文娟,等.黑灵芝中性提取物三萜类含量测定及抗氧化作用研究[J].南昌大学学报,2011,33(4):332-337

[10]彭珍华,韩本,赵声兰,等.三萜类化合物抗HIV研究进展[J].天然产物研究与开发,2009,21(5):258-262

[11]Hong Huey Ko,Chi Feng Hung,Jih Pyang wang,et al.Antiinflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma Lucidum and G.tsugae[J].Phytochemistry,2008,69(1):234-239

[12]陈慧,王晓玲,刘高强.灵芝子实体中三萜酸的提取及其稳定性[J].食用菌学报,2015,22(4):58-64

[13]蒉霄云,何晋浙,王静,等.微波提取灵芝中三萜类化合物的研究[J].中国食品学报,2010,10(2):89-96

[14]洪文龙,童斌,赵格.响应面法优化灵芝子实体三萜提取工艺的研究[J].食品研究与开发,2014(11):42-46

[15]姚松君,黄生权,陈壮耀,等.超声辅助提取灵芝三萜的工艺研究[J].现代食品科技,2009,25(10):1220-1223

[16]宋师花,贾晓斌,陈彦,等.超临界CO2萃取灵芝子实体中的三萜类成分[J].中国中药杂志,2008,33(17):2104-2107

[17]陈飞,马闽卉,梁运祥,等.不同品种灵芝固态发酵菌丝体多糖和三萜含量的比较[J].食品科技,2011,36(9):19-22

[18]贾瑞博,赵慧,刘凯丽,等.树舌灵芝总三萜提取工艺优化及其抗氧化作用研究[J].应用化工,2016,45(6):1030-1035