抑制BCAR1降低肺癌细胞系A549 p-P38表达

黄 伟，阮姝琴，王如文，范小青

(1.重庆市人民医院 胸外科, 重庆 400013； 2.重庆市人民医院 肿瘤血液科, 重庆 400013；3.第三军医大学大坪医院 野战外科研究所 全军胸外科中心， 重庆 400042)

全世界每年大约新增135万肺癌患者，肺癌已成为死亡的主要原因之一。虽然目前通过手术、化放疗、靶向治疗多学科综合标准治疗取得一定效果，但由于肺癌复杂的生物学功能， 其预后仍然较差。

因此，需要进一步研究肺癌生物学机制，改善其治疗效果[1- 2]。乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白(breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)是重要衔接蛋白，属于CAS(Crk-associated substrate)骨架蛋白家族一员，能与其他蛋白形成复合物，调控细胞迁移、凋亡和增殖等[3]。最近有研究报道BCAR1在乳腺癌、前列腺癌、食管癌和胶质母细胞瘤等多种肿瘤中过表达，并与肿瘤转移、预后和耐药密切相关[4- 5]。目前BCAR1与肺癌相关报道尚少，本研究前期报道[6- 7]BCAR1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织高表达，与肿瘤分化程度和预后相关，并且NSCLC肺癌患者血清中BCAR1水平也高于正常人，切除肺癌后BCAR1水平随之下降，因此本研究提出BCAR1可作为NSCLC诊断和判断预后指标。为进一步研究BCAR1在肺癌形成中的作用，本研究成功在肺癌A549细胞构建BCAR1基因siRNA慢病毒干扰载体，并建立稳定表达细胞株[8]。因此，本研究拟探讨抑制BCAR1对肺癌A549细胞周期、增殖和迁移侵袭的影响，并分析潜在的作用机制，从而为肺癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料: RPMI- 1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司);羊抗鼠和羊抗兔二抗(Sigma公司)；P38鼠抗人单克隆抗体(BD公司)；p-P38兔抗人单克隆抗体(Cell Signaling公司)；β-actin鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.1.2 细胞:慢病毒干扰BCAR1基因肺癌细胞株A549、慢病毒阴性对照肺癌细胞株A549和肺癌细胞系A549(第三军医大学大坪医院胸外科实验室)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理:细胞分为对照组(肺癌细胞系A549)、阴性对照组(慢病毒阴性对照肺癌细胞株A549)和干扰组(慢病毒干扰BCAR1基因肺癌细胞株A549)。复苏细胞后，按常规方法在含10% FBS的RPMI1640完全培养基中培养，细胞置5% CO2、37 ℃饱和温度培养箱中进行培养。待细胞增殖至汇合度为80%～85%时，进行常规传代培养。取对数增殖的细胞进行后续实验操作。

1.2.2 Western blot检测P38、p-P38蛋白表达: PBS冲洗细胞3次，加入蛋白裂解液，提取各组细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭60 min；分别加入P38鼠抗人单克隆抗体(1∶100稀释)，p-P38兔抗人单克隆抗体(1∶100稀释)，β-actin鼠抗人单克隆抗体(1∶3 000稀释),4 ℃过夜；TBST洗膜后，分别加入二抗羊抗鼠抗体(1∶5 000稀释)和羊抗兔抗体(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h；洗膜后，ECL化学发光显色，利用Bio-Rad公司凝胶成像系统和分析软件进行图像扫描和分析。

1.2.3 克隆形成实验：取对数增殖期细胞用胰蛋白酶消化，离心收集，制成细胞悬液，反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞在95%以上，以2.0×102个细胞/孔接种于培养皿中，并以十字方向轻轻晃动，使细胞分散均匀，5% CO2、37 ℃饱和温度培养箱中进行培养，连续培养13 d，当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，去除培养液，用1 mL无水乙醇洗涤2次，晾干后，Giemsa染色，记录有50个细胞以上的克隆数量，计算集落形成率(%)=(集落数/接种细胞数)×100。

1.2.4 流式细胞计量术测量细胞周期：用胰蛋白酶消化细胞，收集于离心管中。用PBS洗涤细胞1次，再用PBS重悬细胞，计数并调整细胞为5×105个/mL。按照细胞周期检测试剂盒说明进行实验：离心沉淀后吸尽培养基，加入70%乙醇4 ℃固定4 h，加入100 μL RNaseA，37 ℃水浴30 min；每管再加入碘化丙啶(PI)染液400 μL，4 ℃染色45 min；流式细胞仪分析，记录激发波长488 nm处的红色荧光，通过BD软件分析细胞各周期分布情况。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭：小室内加入Matrigel胶。常规消化收集细胞，无血清培养液制成细胞悬液，加入小室上室，每个小室细胞数量为1.0×106个，下室加入500 μL含有10% FBS的培养基，常规培养24 h。用棉签擦去小室上面的细胞，PBS洗2次，多聚甲醛固定30 min，用结晶紫染色30 min，然后PBS清洗，在倒置显微镜下计数穿过膜的细胞，随机取5个视野拍照，计数并统计结果。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移：常规消化细胞，细胞以5.3×105个细胞/孔密度接种于6孔板，待接近形成细胞单层时，用200 μL的枪头在24孔板内均匀划直线，更换含1%FBS的培养基继续培养48 h。在0、24和48 h于显微镜下观察并拍照，通过多点测量划痕边缘之间距离，计算平均划痕愈合滤。 划痕愈合滤(%)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 抑制BCAR1表达对p-P38和P38蛋白表达的影响

p-P38蛋白慢病毒干扰组表达显著低于对照组和阴性对照组 (P<0.05)(图1)。

2.2 抑制BCAR1对A549细胞克隆形成的影响

干扰组与其他两组比较克隆形成率显著减少(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control and negative group图1 Western blot检测抑制BCAR1对P38和p-P38蛋白表达的影响Fig 1 Effect of BCAR1 knockdown on expression of P38 and p-P38 protein by Western

A.control group; B.negative group; C.interference group;*P<0.05 compared with control and negative group图2 抑制BCAR1对A549细胞克隆形成的影响Fig 2 Effect of BCAR1 knockdown on colony formation of A549

2.3 抑制BCAR1对A549细胞周期的影响

干扰组与其他两组细胞比较，G1期比例显著增高(P<0.05)(图3)。

2.4 抑制BCAR1对A549细胞侵袭的影响

干扰组与其他两组细胞比较，穿膜数显著减少(P<0.05)(图4)。

2.5 抑制BCAR1对A549细胞迁移的影响

干扰组细胞与其他两组细胞比较，迁移能力显著降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

BCAR1首先在v-Src与v-Crk转化鸡胚细胞中被发现，因分子质量为1.3×105，又被命名为P130CAS。BCAR1主要由4个部分组成：氨基末端结构域、羧基末端结构域、底物结合区和4螺旋束区，这些结构是众多细胞调控因子结合的部位[4,9]。

在乳腺癌中首先发现BCAR1，研究最为广泛。通过ELISA检查2 593例乳腺癌患者标本，发现BCAR1与雌孕激素受体、年龄、月经状态呈正相关，与肿瘤分化程度、总体生存率和无复发生存率呈负相关[10- 11]。通过将BCAR1转染到人乳腺癌雌激素依赖细胞ZR- 75- 1中，使其对雌激素产生抵抗，并对他莫昔芬产生耐药反应[10]。

目前鲜有BCAR1与肺癌关系报道，前期通过体内实验证实BCAR1可作为NSCLC诊断和判断预后的指标[6- 7]。本次研究想通过体外实验证明BCAR1在NSCLC形成过程中相关机制。首先通过Western blot检测3组A549细胞中P38和p-P38蛋白表达，因为P38信号途径是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-active protein kinase，MAPK)重要分支，参与了多种肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移等调控[12- 13]。在乳腺上皮细胞中BCAR1表达增加，或仅是羧基端BCAR1表达增加，可激活P38信号通路，导致细胞增殖和迁移增加[14]。本次研究发现干扰组A549细胞中P38的表达只略低于其他两组， 而p-P38表达则显著低于其他两组，说明抑制BCAR1表达可下调A549细胞中p-P38表达，从而影响A549细胞生物学功能，而P38表达只略下降，说明P38可能还受到其他细胞因子调控，相关机制还需进一步研究。

A.control group; B negative group; C interference group; *P<0.05 compared with control and negative group图3 抑制BCAR1对A549细胞周期的影响Fig 3 Effect of BCAR1 knockdown on cell cycle of A549

有报道[4]使用Src激酶抑制剂SKI- 606可以减少BCAR1磷酸化，抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移。此外，BCAR1通过血管内皮生长因子非酪氨酸激酶受体(NRP1)信号途径，促进胶质母细胞瘤侵袭[9]。本次研究结果显示：干扰组增殖、侵袭和迁移能力显著低于其他两组，干扰组细胞出现G1期阻滞，表明BCAR1在NSCLC形成中发挥重要作用。

综合本次和前期研究成果，推测BCAR1可作为新NSCLC癌基因,其可通过上调p-P38表达促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移。因此，BCAR1不仅可作为诊断和判断预后指标，更可成为NSCLC治疗新靶点，为NSCLC临床基因治疗提供新的理论依据。

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