乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导破骨细胞成熟方法研究

王硕

（天津医科大学肿瘤医院生物化学与分子生物学研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津300060）

在女性人群中乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，每年将近有160万患者被确诊为乳腺癌，其中30%～40%的乳腺癌患者会发生转移，而超过90%死亡患者发生乳腺癌转移[1]。骨是乳腺癌常见转移器官，乳腺癌引发的骨转移通常为溶骨性骨转移[2]。骨组织由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞构成[3]，骨细胞是骨组织中一大类细胞的总称，参与调节骨组织机械敏感性；成骨细胞在骨微环境中参与骨基质的合成、分泌及矿化；破骨细胞参与骨基质的重吸收，与成骨细胞共同维持骨稳态的平衡[4]。在骨微环境中破骨细胞一旦被异常激活，骨稳态便遭到打破，进而引发溶骨性损伤[5]。因此，体外诱导破骨细胞分化成熟实验具有重要作用，是体内乳腺癌骨转移机制研究的基础工作。虽然破骨细胞体外诱导成熟的基础实验方法已有报道[6-7]，但是有关乳腺癌细胞系MDAMB-231细胞条件培养基体外诱导破骨细胞成熟的研究却鲜有报道。肿瘤细胞的培养上清液中所含有肿瘤细胞分泌因子通过肿瘤外分泌的方式与其它的细胞膜表面受体相结合，进而影响其作用以及功能。肿瘤细胞可以分泌很多细胞因子，例如TGFβ、VEGF、IGF-Ⅱ等，这些细胞因子经过外分泌的作用可通过信号转导影响其它细胞的侵袭迁移能力、增殖能力、分化障碍、凋亡强弱等。同样MDA-MB-231肿瘤细胞培养上清中含有很多种分泌因子，这些细胞因子是不是可以诱导小鼠破骨细胞成熟就成了研究的重点。笔者课题组前期研究发现，由于肿瘤细胞条件培养基成分复杂，乳腺癌细胞系MDAMB-231细胞条件培养基体外诱导破骨细胞成熟采用常规诱导方法通常容易导致炎症反应的发生。因此，本文通过设计4组不同诱导方法，探究乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞条件培养基体外诱导破骨细胞分化成熟的最佳实验条件，为肿瘤细胞条件培养基体外诱导破骨细胞分化成熟提供可靠实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明雌鼠10只（华阜康，北京），6～8 周龄（约 20 g）。

1.1.2 实验细胞 乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），MDA-MB-231 细胞培养于含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的RPMI-1640培养基（Invitrogen公司）；所有细胞培养均加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，对数期细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.1.3 试剂 α-MEM基础培养基，RPMI-1640基础培养基和灭活胎牛血清购自美国Gibco公司；小鼠NF-κB受体激活子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）购自美国Peprotech公司；100×青霉素/链霉素混合液购自美国Invitrogen公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒购自美国Sigma公司；红细胞裂解液（Tris-HCl，0.01mol/L，pH 7.4） 和 PBS （NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.083 g，KH2PO4·12H2O 0.261 g，pH7.2）。

1.2 方法

1.2.1 分离小鼠骨髓细胞 颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精浸泡小鼠全身3～5 min，无菌环境中分离小鼠胫骨和股骨。将分离得到的胫骨和股骨浸泡于37℃PBS中，分别剪去胫骨和股骨两端，并用PBS冲洗骨髓腔，至骨髓腔发白，收集骨髓细胞，红细胞裂解液破除骨髓腔中的红细胞，收集剩余骨髓细胞。1.2.2 细胞计数 首先将计数板以及盖玻片擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上；然后将细胞悬液吸出20 μL，滴加在盖片边缘，使细胞悬液充满计数板与盖玻片之间（盖玻片与计数板之间不能有气泡，也不可将细胞悬液流出）；最后将计数板静止2～3 min后，计算计数板4大格细胞总数，压线的细胞只计左侧和上方的，公式计算：细胞数/mL=4大格细胞总数/4×104，公式中除以4，因为计数计的是4大格的细胞数。

1.2.3 实验分组 A组：正常贴壁法分离24 h后未贴壁细胞，接种到12孔板，分别用30 ng/mL M-CSF处 理 3 d，30 ng/mL M-CSF，50 ng/mL RANKL 和20%MDA-MB-231细胞条件培养基联合诱导7 d（每2 d换1次液）；4%多聚甲醛固定细胞，TRAP染色，镜下观察，统计TRAP阳性细胞数和直径。B组：正常贴壁法分离24 h后未贴壁细胞，接种到12孔板，分别用30 ng/mL M-CSF处理3 d，30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL诱导 2 d，30 ng/mL M-CSF，50 ng/mL RANKL和 20%MDA-MB-231细胞条件培养基联合诱导7 d（每2 d换1次液）；4%多聚甲醛固定细胞，TRAP染色，镜下观察，统计TRAP阳性细胞数和直径。C组：贴壁前加入15ng/mL M-CSF，24 h后分离未贴壁细胞，接种到12孔板，分别用30 ng/mL M-CSF处理3 d，30 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL和20%MDA-MB-231细胞条件培养基联合诱导7 d（每2 d换1次液）；4%多聚甲醛固定细胞，TRAP染色，镜下观察，统计TRAP阳性细胞数和直径。D组：贴壁前加入15 ng/mL M-CSF，24 h后分离未贴壁细胞，接种到12孔板，分别用30 ng/mL M-CSF处理3 d，30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL 诱导 2 d，30 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL和20%MDA-MB-231细胞条件培养基联合诱导7 d（每2 d换1次液）；4%多聚甲醛固定细胞，TRAP染色，镜下观察，统计TRAP阳性细胞数和直径。

1.2.4 TRAP染色 TRAP染色步骤按Sigma试剂盒说明书进行，具体步骤如下：37℃预热足够的去离子水，向50 mL离心管中分别加入0.25 mL快速石榴型碱溶液和0.25 mL亚硝酸盐溶液，轻轻混匀，室温静置2 min，加入0.25 mL萘酚AS-BI磷酸溶液，加入1 mL醋酸盐溶液，加入22.5 mL去离子水（37℃），加入0.5 mL酒石酸盐溶液，充分混匀，37℃水浴加热（整个过程注意避光），弃细胞上清，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛37℃固定20 min，PBS洗涤2次，弃上清，加入配置的37℃染色液，37℃避光孵育1 h，去离子水充分洗涤，加入苏木精溶液复染，自来水漂洗，晾干，显微镜观察，统计TRAP阳性细胞数和直径。

1.3 统计学分析 体外细胞学实验每组3次重复实验，每个实验独立重复至少2次。实验数据采用±s表示，实验组与对照组之间比较采用Student’s t检验。统计分析采用SPSS17.0统计软件。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDA-MB-231 细胞条件培养基容易诱发破骨细胞在分化早期发生炎症反应，采用正常贴壁法分离得到未贴壁骨髓细胞，用30 ng/mL M-CSF处理3 d后，直接采用20%MDA-MB-231细胞条件培养基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL联合诱导7 d（A组）；TRAP染色后镜下观察发现不但没有成熟的破骨细胞形成反而发生严重的炎症反应（图1 A组）。此外，采用贴壁前加入15 ng/mL M-CSF贴壁分选分离得到的未贴壁骨髓细胞，用30 ng/mL M-CSF处理3 d后，再直接采用20%MDA-MB-231细胞上清、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL联合诱导7 d，TRAP染色后镜下观察发现同样没有成熟的破骨细胞形成并且同样有炎症反应发生（图1C组）。

图1 A组和C组TRAP染色结果Fig 1 TRAP staining results of group A and group C

2.2RANKL和M-CSF联合诱导后，MDA-MB-231细胞条件培养基能够促进破骨细胞分化成熟 通过正常贴壁法分离得到的未贴壁细胞，通过30 ng/mL M-CSF处理3d后，采用30ng/mLM-CSF和50ng/mL RANKL诱导2 d，再采用20%MDA-MB-231细胞条件培养基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL联合诱导7 d；TRAP染色后发现能够诱导出成熟的小鼠骨髓源性破骨细胞（图2 B组）。与此相似的是，贴壁前加入15 ng/mL M-CSF贴壁分选分离得到的未贴壁骨髓细胞，通过30 ng/mL M-CSF处理3 d后，再采用30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL诱导2 d，最后采用20%MDA-MB-231细胞条件培养基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL联合诱导7 d，TRAP染色后发现同样能够诱导出成熟的小鼠骨髓源性破骨细胞（图2 D组）。

图2 B组和D组TRAP染色结果Fig 2 TRAP staining results of group B and group D

2.3 贴壁前采用M-CSF刺激骨髓细胞能够分选出更多具有活力的破骨前体细胞 为了探究M-CSF在贴壁分选骨髓腔细胞过程中的作用。通过比较正常贴壁法分离未贴壁骨髓细胞和贴壁前加入15 ng/mL M-CSF贴壁分选分离得到的未贴壁骨髓细胞两种方法发现，在都能诱导出成熟破骨细胞前提下，采用贴壁前加入15 ng/mL M-CSF贴壁分选分离得到的未贴壁骨髓细胞能够诱导出数量更多，体积更大的成熟破骨细胞（图3）。

图3 成熟破骨细胞相对数量和直径统计Fig 3 The relative number of mature osteoclasts and diameter statistics

3 讨论

骨是乳腺癌常见的远处转移器官，乳腺癌骨转移主要导致溶骨性病变，严重影响患者生存质量和生存期[8]。体外诱导破骨细胞分化成熟实验是乳腺癌溶骨性骨转移研究的基础。本研究以乳腺癌细胞MDA-MB-231条件培养基为对象，对乳腺癌细胞条件培养基诱导破骨细胞分化成熟实验条件作了探究。同时发现在破骨细胞分化早期，乳腺癌细胞MDA-MB-231条件培养基容易引起单核细胞发生炎症反应；在破骨细胞分化中后期，乳腺癌细胞MDA-MB-231条件培养基能够促进破骨前体细胞分化成熟。

根据文献报道，在破骨细胞分化成熟过程中，MCS-F和RANKL是两种重要的细胞因子。M-CSF通过和细胞表面受体c-Fms相互作用[9]，抑制前体破骨细胞的凋亡、促进前体破骨细胞增殖[10]、促进破骨细胞表达RANK；RANKL通过和RANK相互作用，激活TNF受体相关因子6（TRAF6）和c-Fos信号通路，促进破骨细胞分化相关转录因子的表达[11-12]，最终促进破骨细胞分化成熟。破骨细胞体外诱导的研究方法已有很多文献报道，但对于体外肿瘤细胞（尤其是骨转移好发肿瘤）条件培养基诱导破骨细胞分化成熟的详细研究方法却鲜有报道。肿瘤细胞条件培养基是一个复杂的体系，包含各种细胞因子、受体、酶类及外泌体[13-14]等，因此，肿瘤细胞条件培养基诱导破骨细胞分化成熟的研究不同于普通的破骨细胞分化成熟研究。在破骨细胞分化早期，乳腺癌细胞MDA-M-231条件培养基容易引起炎症反应，推测一方面是肿瘤细胞分泌大量炎症因子，另一方面是分化早期的细胞是单核细胞，单核细胞极易发生炎症反应，经RANKL和M-CSF诱导后单核细胞逐渐分化成前体破骨细胞，此时炎症反应便不再容易发生，但其具体机制有待继续研究。

本研究结果显示RANKL和M-CSF联合诱导后再用MDA-MB-231细胞上清刺激能够促进破骨细胞分化成熟。因此，在破骨细胞分化成熟的早期，MDA-MB-231细胞条件培养基不但不具有促进其分化成熟的作用，反而容易引起单核细胞发生炎症反应。贴壁前采用M-CSF刺激骨髓腔细胞能够分选出更多具有活力的破骨前体细胞。乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导小鼠骨髓源性破骨细胞分化成熟最佳条件是：15 ng/mL M-CSF处理贴壁分选前的骨髓细胞24 h后，用30 ng/mL M-CSF处理未贴壁骨髓单核细胞3 d，采用30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL诱导2 d，最后，采用20%MDA-MB-231细胞条件培养基、30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL联合诱导7 d。

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