黄芪及其复配组合调节正常小鼠免疫功能的探索△

王晨，于冰莉，崔洁，侯俊玲*，王文全，*，张莉

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

黄芪始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌的功能，常用于治疗脾肺气虚诸症，有“补气之长”的美称[1]。中医药学中“免疫”一词，最早出现于18世纪《免疫类方》一书，意为免除“疫病”的危害[2]。中医认为疾病的发生是由于人体正气与致病因素的正邪斗争中正不敌邪而引起的，进而导致阴阳失调，气血逆乱[3]。《黄帝内经》提出了“正气存内，邪不可干。邪之所凑，其气必虚”的理论。即正气充足则邪气无法侵袭人体，邪气一旦侵入人体则表明正气已经虚衰。由此可见，正气起到了护卫人体免受邪气侵害的功能，这与西医学中机体的免疫功能学说类似[4]。传统中医理论从扶正祛邪这一基本治则出发[2]，通过补中益气、补气固表、充盈卫气以达到调节人体免疫力的功效。现代药理学研究发现，中药多糖最为重要且效果确切的药理活性莫过于免疫调节作用。传统中药尤其是补益类中药主要通过调节机体的免疫功能而发挥其独特的治疗作用，且这类药物的活性部位主要是多糖[5]。本文以传统中医理论为基础，借助现代药理研究手段，通过探讨黄芪及其与各药味复配组合对正常小鼠体质量、脏器指数、血清溶血素含量、腹腔巨噬细胞吞噬率的影响，根据保健食品评价相关指标，从而筛选出最佳复配组合，为以黄芪为原料的相关健康功能产品开发提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

RE-Ⅱ旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)；宝特Bio-TekELX800光吸收酶标仪(济南鑫贝西生物技术有限公司)；OLYMPUSCX23生物显微镜(奥林巴斯中国有限公司)；BKQP-75L立式高压灭菌锅(济南博鑫生物技术有限公司)。

1.2 试剂与材料

SA缓冲液(上海源叶生物有限公司)；2%压积羊血细胞(SRBC)、10%SRBC和1%鸡红细胞(郑州九龙生物制品有限公司)；文齐试剂(天津市现代高科技研究院中山研究所)；溴甲酚紫(天津市巴斯夫化工有限公司)；Giemsa染液、Hanks液和补体(豚鼠血清)(北京耀威振兴科技有限公司)；无支原体小牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；香菇多糖胶囊(湖北创力药业有限公司，批号：20160502)。

黄芪、女贞子、大枣、陈皮、甘草、覆盆子、黄精购自河北美威药业股份有限公司。酒苁蓉购自内蒙古王爷地生物制品股份有限公司。各中药样品由中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定，分别为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、木犀科植物女贞子LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实、鼠李科植物枣ZiziphusjujubeMill的干燥成熟果实、芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco.的干燥成熟果皮、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎、蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu.的干燥果实、列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎，百合科植物黄精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根茎，样品保存于北京中医药大学中药资源系标本室。

1.3 动物

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中有关调节免疫的功能产品中对小鼠种类及模型的要求[6]，选择正常BALB/c小鼠为本研究实验动物及模型。

BALB/c小鼠，雄性，18～22 g，70只，由中国医学科学院药用植物研究所动物实验中心提供，许可证编号：SYXK(京)2013-0023。

2 方法

2.1 药味配伍设计

以《太平惠民和剂局方》中经典补虚方黄芪六一汤为基础[7]，在临床医生的建议下，增加酒苁蓉、大枣组成黄芪-甘草A组方，增加酒苁蓉、陈皮组成黄芪-甘草B组方。以贞芪扶正颗粒为基础[8]，在临床医生的指导下，增加黄精构成黄芪-女贞子A组方，增加陈皮、覆盆子构成黄芪-女贞子B组方。另设立黄芪多糖组，进行综合分析比较。

2.2 黄芪多糖提取

将黄芪磨粉，过40目筛，水提醇沉(70 ℃提取2 h，提取2次，离心合并上清液，经旋转蒸发浓缩后，4倍体积无水乙醇沉淀)，离心取沉淀。然后用蒸馏水复溶，过大孔树脂脱色脱蛋白，收集流分后再次浓缩，冷冻干燥，得白色粉末，得率为0.12 g·g-1，4 ℃贮存，备用。

2.3 供试药液配置

各组方采用传统汤药提取工艺进行提取(提取0.5 h、提取2次、料液比1∶10)，烘干，制得干浸膏粉，其各组方干浸膏得率为：黄芪-甘草A组，0.56 g·g-1；黄芪-甘草B组，0.50 g·g-1；黄芪-女贞子A组，0.19 g·g-1；黄芪-女贞子B组，0.25 g·g-1。采用蒸馏水溶解，按人(60 kg体质量)每日用量的10倍量配置供试液，4 ℃保存。

2.4 阳性药液配置

称量适量香菇多糖胶囊内容物，蒸馏水溶解，配置为31.00 mg·mL-1阳性药液，4 ℃保存。

2.5 小鼠分组与给药方式

BALB/c小鼠，雄性，18～22 g，70只。适应性喂养3 d后随机分成7组，每组10只，分别为正常空白组、阳性药组、黄芪-甘草A组、黄芪-甘草B组、黄芪-女贞子A组、黄芪-女贞子B组、黄芪多糖组。阳性药组、供试液组每天以灌胃方式分别给予阳性药液、供试药液1次，正常空白组给予相同容量的蒸馏水1次，连续灌胃30 d。各组均正常饮食饮水。各供试液组给药量为以生药量为依据的各组方人体(60 kg体质量)推荐量的10倍，具体给药剂量见表1。

2.6 免疫功能检测方法

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中对免疫调节功能产品检测指标的指导及建议，选定体质量、脏器指数、血清溶血素测定及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血细胞实验为本研究的相关测定指标。

2.6.1 体质量、脏器指数的测定 灌胃，禁食12 h后，测小鼠体质量，小鼠脱颈处死，摘取脾脏及胸腺称质量，按公式(1)计算脏器指数。

(1)

2.6.2 血清溶血素测定(HC50值) 参考佟长青等的方法[9]，在灌胃第26天时，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%压积羊血红细胞进行致敏。第30天灌胃后禁食12 h，摘小鼠眼球取血，2000 r·min-1离心分离血清，备用。取96孔板，设样品孔和空白对照孔，空白对照孔每孔加入100 μL稀释的SA缓冲液；样品孔每孔加入稀释后的血清100 μL(血清稀释方法：血清10 μL，用1 mL稀释后的SA缓冲液进行稀释)；再依次加入10%(V/V)SRBC 50 μL，补体100 μL(用SA溶液稀释)，置37 ℃恒温水浴中保温30 min，以1500 r·min-1离心10 min。然后分别从空白孔和样品孔中各取上清液50 μL，加入新的96孔培养板中，加文齐试剂150 μL。同时在96孔培养板内设置半数溶血孔，往半数溶血孔加入10%(V/V)压积羊血红细胞12.5 μL，再加文齐试剂至200 μL。振荡，混匀，放置10 min后用全自动酶标仪在540 nm处测定各孔光密度值(A)，按公式(2)计算HC50值。

(2)

2.6.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血细胞实验 本方法参考《保健食品检验与评价技术规范》[6]，在灌胃第26天时，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%压积羊血红细胞进行致敏。第30天灌胃后禁食12 h，乙醚麻醉，脱颈处死后腹腔注射加小牛血清的Hank′s液，4 mL/只。吸取腹腔洗液，0.5 mL腹腔洗液与0.5 mL 1%鸡血红细胞悬液置于试管中进行充分混匀。用注射器吸取0.5 mL混合液，滴到载玻片上，37 ℃孵育15 min。孵育结束后，拿出载玻片迅速用0.9%氯化钠溶液将未贴壁细胞冲掉。然后用甲醇液固定，固定玻片1 min左右，将玻片用Giemsa液进行染色，约15 min。用蒸馏水轻轻冲洗载玻片，之后将载玻片放置于平台上自然晾干，在显微镜40倍物镜下计数，按公式(3)计算吞噬率。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率。

(3)

2.7 数据处理

3 结果

3.1 小鼠体质量、脏器指数的测定

各组小鼠体质量、脾脏指数、胸腺指数变化见表1。

体质量可以直观反映动物整体健康状况的好坏。在小鼠实验周期结束时，测量其体质量后发现，与正常空白组体质量相比，黄芪多糖组的小鼠体质量显著高于空白组(P<0.05)，黄芪-女贞子B组的小鼠体质量显著低于正常空白组(P<0.05)，其余各组与正常空白相比差异无统计学意义(P>0.05)。

在实验周期结束后，分别取小鼠脾脏、胸腺，称质量，计算脾脏指数、胸腺指数。从中发现，与正常空白组脾脏指数相比，黄芪-甘草A组的脾脏指数显著高于空白组(P<0.05)，而其余各组与空白相比差异无统计学意义(P>0.05)。

与正常空白组胸腺指数相比，黄芪-甘草A组、黄芪-甘草B组、黄芪-女贞子A组及黄芪-女贞子B组的胸腺指数显著高于空白组(P<0.05)，其余各组与空白相比差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2 小鼠血清溶血素的测定(HC50值)

各组小鼠HC50值变化见表2。

由B淋巴细胞分化产生的抗体参与机体的体液免疫，在绵羊红细胞抗原的刺激下，小鼠B淋巴细胞产生溶血素，其水平的高低反映机体的体液免疫能力强弱，且溶血素的含量与机体体液免疫能力呈正相关[10]。根据表2可知，与正常空白组相比较，阳性药组和黄芪-甘草B组均能显著增加小鼠的HC50值(P<0.05)，其余各给药组无统计学差异(P>0.05)。

3.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血细胞的测定

各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血细胞吞噬百分率变化见表2，形态图见图1。其中小鼠巨噬细胞无明显边界膜、细胞颜色均一、无明显深颜色颗粒，吞噬鸡血后有明显细胞边界、有明显深色颗粒。

根据表2可知，与正常空白组相比较，阳性药组、黄芪-甘草A组、黄芪-甘草B组、黄芪-女贞子B组及黄芪多糖组的吞噬百分率均显著升高，黄芪-女贞子A组无统计学差异。吞噬百分率由高到低顺序依次为黄芪-甘草B组>黄芪-女贞子B组>黄芪多糖组>阳性药组>黄芪-甘草A组>黄芪-女贞子A组>空白组。黄芪-甘草组间比较，可以发现黄芪-甘草B组显著高于黄芪-甘草A组，说明黄芪-甘草与酒苁蓉、陈皮配伍在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力上好于黄芪-甘草与酒苁蓉、大枣配伍。在黄芪-女贞子组间，发现黄芪-女贞子B组明显好于黄芪-女贞子A组，表明黄芪-女贞子与陈皮、覆盆子配伍较优于与黄精配伍。综上所述，黄芪-甘草与肉苁蓉、陈皮配伍的效果最佳。

表1 各实验组小鼠体质量与脏器指数变化情况

注：与正常空白组相比，*P<0.05。

表2 各实验组小鼠HC50值与吞噬百分率变化情况

注：与正常空白组相比，*P<0.05；黄芪-甘草组间相比，▲P<0.05；黄芪-女贞子组间相比，△P<0.05。

注：图中实线箭头指示巨噬细胞，虚线箭头指示被吞噬的鸡红细胞。图1 各实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红血细胞的计数

4 讨论与结论

免疫功能是机体防御和清除各种有害因素的能力，即体内“正气”的主要体现。现代医学对机体的免疫功能进行评价主要通过观察对机体非特异性免疫功能(巨噬细胞吞噬活性)和特异性免疫功能的影响，其中特异性免疫功能又包括细胞免疫和体液免疫(血清溶血素含量)[11]。本文通过研究黄芪及其复配组合对正常小鼠体质量、脏器指数、血清溶血素含量及腹腔巨噬细胞吞噬率的影响，筛选出了具有调节机体免疫功能的较优复配组合。

在临床上，调节免疫功能的物质多为蛋白类药物，如干扰素等。植物类药物则多为单纯多糖，如香菇多糖等。两种类型药物生产工艺较复杂，成本较高，且均为处方药物，且有些药物还具有一定的不良反应，不适合平时保健使用。本研究中所选药味多为药食两用或可用于保健食品的中药。因此，可制作为袋泡茶、固体饮料等，用作日常保健使用。同时，本研究设香菇多糖为阳性药，并与黄芪多糖比较，试寻找出与阳性药及黄芪多糖相当或优于二者的组方复配，用以相关健康产品开发。

本研究结果表明，在临床推荐剂量下，黄芪及其复配组合可不同程度上调节小鼠的免疫能力。其中，单一黄芪多糖可显著增加小鼠体质量、脾脏指数及腹腔巨噬细胞吞噬率；黄芪与甘草、酒苁蓉、陈皮复配后在胸腺指数、血清溶血素含量及腹腔巨噬细胞吞噬百分率上有显著增加；黄芪与甘草、酒苁蓉、大枣配伍可显著增加小鼠脏器指数和腹腔巨噬细胞吞噬百分率；黄芪与女贞子、黄精配伍可显著增加小鼠胸腺指数；而黄芪与女贞子、陈皮、覆盆子复配可显著增加小鼠胸腺指数和腹腔巨噬细胞吞噬百分率。根据各给药组对各指标的影响强弱及有无显著改变，综合分析发现，在临床推荐剂量下，黄芪及其相关复配组合调节小鼠免疫功能的药效大小依次为：黄芪-甘草B组>黄芪多糖组>黄芪-女贞子A组>黄芪-甘草A组>黄芪-女贞子B组。

上述结果表明，单一黄芪多糖具有一定程度的调节免疫作用；黄芪-甘草组、黄芪-女贞子组也均可一定程度上调节免疫功能，但黄芪-甘草组调节免疫功能的作用强于黄芪-女贞子组。同时，黄芪-甘草与酒苁蓉、陈皮配伍后，其调节免疫的功效强于黄芪多糖组、黄芪-女贞子组及黄芪-甘草A组，且相关指标多数优于或与阳性药组持平。黄芪-甘草与酒苁蓉、陈皮配伍后，在黄芪与酒苁蓉补益的基础上，加之陈皮理气健脾的功效，使之补而不腻，整体上调节身体机能，可能是本方效果优于单一黄芪多糖及其他复配组合的主要原因。但本实验设定剂量的依据为临床医生根据调节人免疫功能而推荐的处方，经换算得到小鼠的灌胃剂量，目的是初步探索推荐剂量下的不同配伍组方，在动物体内是否能够呈现出药效作用，即定性研究；本研究尚未进行组方间的量效关系考察，这也将是后续实验研究的重点。

由此而见，黄芪-甘草与酒苁蓉、陈皮配伍更具有开发为相关健康功能产品的巨大潜力。因此，本研究后续将对该组合进行更加深入的药理活性实验检测及免疫机理研究，以期为相关健康产品研发提供更加切实有力、作用机理清楚的理论参考。

[1] 黄兆生.中药学[M].北京：人民卫生出版社，2010：418-419.

[2] 刘维庆，陈书保，沙涛.中医学与免疫学关系探析[J].辽宁中医杂志，2005，32(12)：1257-1258.

[3] 王冰冰，高永翔.免疫学理论与中医学理论的相关性[J].四川中医，2015，33(2)：34-36.

[4] 魏惠芳，张露芬.从整体观念谈中医“正气”的特点[J].北京中医药大学学报，2009，32(7)：440-442.

[5] 吕小成，张乐帅，王富军.中药多糖的免疫调节作用及研究进展[J].上海中医药大学学报，2016，30(3)：97-101.

[6] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[M].2003.

[7] 王迪，张文风，张杰.黄芪配甘草对小鼠细胞免疫功能的影响[J].长春中医药大学学报，2006，22(3)：42-43.

[8] 李红，任远，吴国泰.贞芪扶正胶囊对免疫力低下小鼠免疫功能的影响研究[J].中国药房，2009，20(24)：1853-1854.

[9] 佟长青，翟兴月，杜影，等.玛咖粉对小鼠免疫功能的影响研究[J].食品安全质量检测学报，2015，6(10)：4188-4192.

[10] 龚吉军，黄卫文，钟海雁，等.油茶粕多肽对小鼠免疫调节功能的影响[J].中国食品学报，2013，13(12)：21-27.

[11] 傅毓，秦惠龙，罗琦，等.固本益肾胶囊对小鼠免疫功能的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(7)：153-155.