CarbAcineto NP快速检测耐碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌的方法学评价

牛 翠，黄红革，马 芳，薛 云，董月稳，时东彦△

(1.河北省邢台市第三医院检验科 054000；2.河北医科大学第二附属医院检验科，石家庄 050000)

多重耐药鲍曼不动杆菌，特别是耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌的报道越来越多，其在院内导致致死性感染，如呼吸机相关肺炎、败血症、脑膜炎等[1-2]。为指导临床及时对感染多重耐药的鲍曼不动杆菌患者选择有效的抗菌药物，现探讨应用CarbAcineto NP方法(改良CarbaAcineto NP实验)，检测耐碳青霉烯酶的不动杆菌属。

1 材料与方法

1.1一般材料 选择邢台市第三医院2015年1月至2016年1月从临床标本分离所得的非重复鲍曼不动杆菌株，共80株，所有菌株用无菌纸片―20 ℃低温保存，采用VITEK COMPACT全自动细菌药敏鉴定仪进行鉴定。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-17056，大肠埃希菌ATCC 25922，均来源于原卫生部临床检验中心。

1.2仪器与试剂 VITEK COMPACT全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)；Gene Amp PCR System 2400热循环仪(美国Applied Biosystems Inc.)； ID Scientific 自动凝胶成像系统(美国 Kodak Inc.)。Premix Taq酶(大连Takara公司)；DNA Marker DL 2000(大连Takara公司)；琼脂糖(美国Hydra Gene公司)；Goldviw显影液(北京赛百盛生物技术公司)；氯化钠(纯度：≥99.5%)(天津市风船化学试剂科技有限公司)；硫酸锌(ZnSO4·7H2O≥99.5%)，苯酚红 (天津永大化学试剂有限公司)；亚胺培南西司他丁钠(杭州默沙东制药有限公司)。

1.3菌株鉴定和药敏试验 80株鲍曼不动杆菌进行纯培养，运用VITEK COMPACT全自动细菌鉴定仪进行药敏试验，按照2015年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判定细菌的耐药情况。

1.4碳青霉烯酶OXA-23基因检测 采用煮沸法在灭菌蒸馏水中加入数个菌落，100 ℃水中煮沸10 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，上清液作为PCR模板。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，OXA-23-F：5′GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA；OXA-23-R：5′ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT。目的片段501 bp，反应体系25 μL。PCR反应条件：预变性 95 ℃ 2 min,循环参数：变性95 ℃ 30 s;退火温度52 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 1 min;延伸72 ℃ 10 min,共循环30次 。 取5 μL PCR产物用1.5%含Goldview染料的琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外成像仪上成像并记录结果。

1.5CarbAcineto NP方法 参照CLSI M100-S25，采用5 mol/L NaCl替代Tris-HCL[3]。取1环(10 μL)在血琼脂平板上过夜培养的细菌，加入含100 μL 5 mol/L NaCl管中振荡混匀。每株菌分别加入2个EP管中，分别设置为A管(对照管)和B管(试验管)。A管中加入100 μL酚红硫酸锌溶液(pH值7.8);B管中加入100 μL含12 mg/mL亚胺培南西司他丁钠的酚红硫酸锌溶液(pH值7.8)，35 ℃温育2 h后观察结果。CarbAcineto NP结果判读:(1)A管和B管都为红色或红-橙色，结果为阴性(非碳青霉烯酶产生株)。(2)A管为红色或红-橙色，B管为黄色、深黄色或浅橙色，结果为阳性(碳青霉烯酶产生株)。(3)若A管为深黄色、黄色、浅橙色或橙色，B管为任何颜色，则结果判为无效。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706和ATCC BAA-1705分别作为阴性和阳性对照。

1.6统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，使用配对χ2检验中McNemar检验对OXA-23和CarbAcineto NP的阳性率进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1鲍曼不动杆菌的耐药性分析 80株鲍曼不动杆菌中49株细菌对碳青霉烯类药物耐药，31株对碳青霉烯类药物敏感。

2.2PCR检测OXA-23基因结果分析 耐碳青霉烯类的49株鲍曼不动杆菌中，有47株携带OXA-23基因，携带率为95.9%。见图1。

注：N表示阴性对照；P表示阳性对照；M表示标记物

图1 OXA-23基因的PCR检测

2.3CarbAcineto NP检测结果分析 耐碳青霉烯类的49株鲍曼不动杆菌中，43株菌CarbAcineto NP方法检测为阳性。31株对碳青霉烯类敏感株中有30株菌CarbAcineto NP检测为阴性。见表1。

表1 OXA-23和CarbAcineto NP的检测结果和耐药性

2.4CarbAcineto NP与PCR的检测结果比较 与PCR比较，CarbAcineto NP方法的阳性预测值为87.8%(43/49)，阴性预测值为96.7%(30/31)。见表2。

表2 CarbAcineto NP和PCR的检测结果比较(n)

3 讨 论

本研究结果表明，80株鲍曼不动杆菌中49株菌对碳青霉烯类耐药，耐药率为61.3%，47株携带OXA-23基因，携带率为95.9%，该院耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的主要基因型为OXA-23型。较多研究报道此类鲍曼不动杆菌的基因型为OXA-23[4-6]。本研究2株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类敏感且携带OXA-23基因，可能原因为这2株细菌无ISAbal提供的强启动子，无法使OXA-23表达量增加，但需进一步的实验证实[7-8]。

Carba NP方法原理是细菌可水解亚胺培南药物的β-内酰胺环，然后通过酚红的颜色变化进行验证[9]。肠杆菌和绿脓杆菌所产生的金属β-内酰胺酶和KPC酶通过实验表明有较高的敏感性(>90%)和特异性(>90%)，然而传统的CarbaAcineto NP方法很难检测出不动杆菌属的碳青霉烯酶，是由于不动杆菌属产生了较弱的OXA型D类碳青霉烯酶。因此，DORTET等[9]建立一种CarbAcineto NP方法(改良的Carba NP实验)检测不动杆菌属的碳青霉烯酶。CarbAcineto NP方法由于挑取的菌株量较CarbaAcineto NP方法增加2倍，因此增加了酶的释放量，且使用5 mol/L NaCl高渗溶液不会像蛋白抽提液(Tris-HCl)会对溶液导致轻微的pH值的改变，更容易使细菌蛋白得到完全释放。 本研究有2株耐碳青霉稀类药物的菌株在CarbAcineto NP和PCR方法检测为阴性，由于鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类药物的机制有很多(如细菌外膜通透性)下降；外排泵高表达；产碳青霉烯酶A类(KPC、GES型)、B类(IMP、VIM、SIM、NDM型)、D类(OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-235型)[10-12]。由于本实验检测方法有限，这2株细菌的耐药机制还需进一步检测。

2株对碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌经CarbAcineto NP方法检测呈阴性，OXA-23基因呈阳性，原因可能是OXA-23基因表达的碳青霉烯酶活性较弱，无ISAbal提供的强启动子，致使未对碳青霉烯类耐药，但仍需进一步实验验证。

DORTET等[9]应用CarbAcineto NP方法对151株产碳青霉烯酶和69株不产碳青霉烯酶的不动杆菌属进行检测，除GES型外，所有为后天获得的碳青霉烯酶基因型。如果由于OXA-51固有基因过度表达或由非碳青霉烯酶机制导致，这项实验结果依然阴性，其敏感性和特异性分别达94.7%和100.0%。而本实验CarbAcineto NP方法的敏感性和特异性分别达87.8%和96.2%，与PCR方法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CarbAcineto NP方法操作相对简单，试剂易于配置，价格低廉，耗时较短，结果易于观察，在临床实验室可很好地开展，是检测产碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌的快速检测方法。

参考文献

[1]TORRES H A,VAZQUEEZ E G,YAGUE G,et al.Multidrug resistant Acinetobacter baumanii:clinical update and new highlights[J].Rev Esp Quimioter,2010,23(1)：12-15.

[2]THOM K A,JOHNSN J K,LEE M S,et al.Environmental contamination because of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii surrounding colonized or infected patients[J].Am J Infect Control,2011,39(9):711-715.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-fifth informational supplement:M100-S25[S]． CLSI，Wayne:PA，USA，2015．

[4]王辉，孙宏莉，廖康，等.北京和广州地区四家医院不动杆菌碳青霉烯酶基因型研究[J].中华检验医学杂志，2005，28(6)：636-641.

[5]WOODFORD N,ELLINGTON M J,COELHO J M,et al.Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp[J].Int J Antimicrob Agents,2006,27(4):351-353.

[6] SUSAN B,SEBASTIAN A.OXA β-lactamases in Acinetobacter:the story so far[J].Antimicmbial Chernotherapy,2006,57(6):1-3.

[7]FIGUEIREDO S.Overexpression of the naturally occurring blaOXA-51 gene in Acinetobacter baumannii mediated by novel insertion sequence ISAba9[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53(9)：4045-4047．

[8]FU Y,ZHOU J,ZHOU H,et al.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiplecities of China[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(4):644-650.

[9]DORTET L,POIREL L,NORDMANN P.Rapid identification of carbapenemase types in enterobacteriaceae and pseudomonas spp.by using a biochemical test[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(12):6437-6440.

[10]DORTET L,POIREL L,ERRERA C,et al.CarbAcineto NP test for rapid detection of carbapenemase-producing Acinetobacter spp[J].J Clin Microbiol,2014,52(7):2359-2364.

[11]DIENE S M,ROLAIN J M.Carbapenemase genes and genetic platforms in Gram-negative bacilli:Enterobacteriaceae,Pseudomonas and Acinetobacter species[J].Clin Microbiol Infect,2014,20(9):831-838.

[12]RUMBO C，GATO E，LOPEZ M，et al.Contribution of efflux pumps，porins，and β-lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57(11)：5247-5257.