miR-135a与前列腺癌细胞增殖相关因子信号转导及转录激活因子6的相关性研究

赵宇明,张 悦,王 华,田 宝,郭冬梅

(河北省秦皇岛市第一医院 066000)

前列腺癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，多发于老年患者，且病死率较高，是目前导致男性癌症病死的主要原因之一[1-2]。随着我国老龄化的不断加重，前列腺癌患者的发病率也持续增高，给家庭和社会带来了沉重的负担，如何控制癌细胞的转移和扩散并提高肿瘤治疗的效果，对改善患者的预后具有重要的临床意义[3-4]。多项研究表明，微小RNA(miRNA)可能在基因表达调控领域起重要作用，而多种miRNA 均参与肿瘤的发生、发展和转移过程[5-6]。为了进一步探讨miR-135a与前列腺癌细胞增殖相关因子信号转导及转录激活因子(STAT6)的相关性，现对前列腺癌DU145细胞分别转染miR-135a序列和空白序列后的细胞增殖情况、细胞周期、迁移和侵袭能力，以及p-STAT6和STAT6蛋白表达、miR-135a表达水平进行检测分析，为临床提供一定的治疗理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 人激素非依赖前列腺癌细胞株DUl45购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。

1.2仪器与试剂 (1)HR22型高速冷冻离心机(日本日立)，FS-7900型PCR仪 (美国应用生物系统公司)， Gel Doc 1000UV型分子定量成像系统(美国BIO-RAD公司)， Napco-541型二氧化碳培养箱(美国)，IX70型倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)，880型酶标仪(德国拜发)。(2)胎牛血清、DMEM培养基、F12K-DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自美国Gibco公司；Mature miRNA-135a和miRNA Negative Control(NC)均购自上海吉玛公司； Trizol提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自美国Epitomics公司；脂质体(Lipofectamine)2000 购自Invitrogen 公司。CCK-8 试剂盒购自碧云天试剂公司；侵袭(Transwell) 小室购自美国Coring 公司；鼠抗人STAT6、p-STAT6 1抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、抗鼠2抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Bio Sharp公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 DU145细胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和50 μg/mL链霉素双抗的F12K-DMEM培养基,在5% CO2、37 ℃恒温培养箱中进行培养，待细胞密度约80%时进行传代培养,取指数生长期细胞进行实验。

1.3.2细胞转染 采用脂质体瞬时转染法进行转染：取对数期生长的细胞株接种于6孔培养板中，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培养基进行培养，待贴壁细胞生长至60%～70%融合后利用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染has-miR135a序列(miR-135a转染组)及NC序列(空白转染组)，转染终浓度为50 mmol/L，严格按照说明书进行操作，转染结束后加培养基增殖培养48 h。

1.3.3MTT检测细胞增殖 分别于转染48 h后取各组细胞悬液利用胰蛋白酶进行消化，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培养基进行培养，并于培养0、24、48 h时取各组细胞悬液加入MTT (5 mg/mL)孵育4 h，随后加入DMSO进行溶解并沉淀，使用酶标仪在490 nm波长测定各孔的吸光值(A)，观察各组细胞增殖情况，每组实验重复3次。

1.3.4流式细胞仪检测细胞周期 分别于转染48 h后取各组细胞悬液，应用胰蛋白酶进行消化，1 000 r/min离心15 min后收集细胞沉淀，以PBS洗涤2次加入预冷75%乙醇在―20 ℃条件下固定24 h，1 000 r/min离心15 min弃上清液，最后加入500 μL细胞周期固定液重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪测定细胞周期。

1.3.5Transwell细胞迁移侵袭实验 先以无血清培养基37 ℃润湿Transwell小室2 h，将转染48 h的各组细胞采用胰酶消化后计数，选取1×106个细胞以无血清的RPMI 1640培养液进行重悬并接种于上室，下室中仅加入10%的完全培养基，37 ℃、5% CO2培养48 h。取出滤膜后以10%多聚甲醛固定，苏木红染色在光镜下观察，计数穿膜细胞数，取其均值代表迁移力量值。

1.3.6蛋白免疫印迹法(Western blot)实验 取转染后培养48 h的各组细胞，洗去培养基后提取总蛋白，并取约75 μg以10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离后转移至孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h；加入STAT6和p-STAT6 1抗后4 ℃孵育过夜，0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入LRH标记的2抗进行反应，0.5%TBS-T溶液洗膜3次，使用化学发光法进行显色，并采用软件进行灰度值分析，计算各目标蛋白与β-actin的灰度比值。

1.3.7RT-PCR实验 取各组转染后培养48 h的细胞，采用Trizol提取试剂盒提取总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录为DNA，在聚合酶作用下进行扩增，扩增引物为上游：5′-CCG ACG CGT TCT TTT CTG TTG CCC CAT C-3′；下游：5′-CCC AAG CTT GGA CCG CAG CAC CTA TCT-3′。扩增条件：95 ℃ 5 min后以95 ℃15 s 变性、60 ℃、60 s 退火、72 ℃ 5 min 30 s延伸，此为1个循环，共40个循环，电泳后进行RT-CPR测定，获得miR-135a的表达水平。严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.12组转染DU145细胞的miR-135a表达结果比较 转染后48 h，miR-135a转染组miR-135a相对表达量为(0.932±0.061)，明显高于空白转染组(0.023±0.002)(t=36.482，P<0.05)。

2.22组miR-135a对DU145细胞的增殖能力结果比较 miR-135a转染组培养24、48 h的OD值分别为(0.210±0.045)、(0.281±0.052)，明显低于空白转染组(P<0.05)。见表1。

表1 2组DU145细胞不同时间点OD值结果比较

2.32组miR-135a对DU145细胞周期影响的结果比较 miR-135a转染组G0/G1期细胞比例为(60.02±6.39)%，明显高于空白转染组(45.34±7.22)%(t=3.730，P<0.05)。

表2 2组DU145细胞迁移和侵袭的结果比较

图1 Transwell细胞迁移和侵袭图

2.42组miR-135a对DU145细胞迁移和侵袭的结果比较 miR-135a转染组迁移细胞数和侵袭细胞数分别为(116.93±30.02)个和(133.02±28.51)个，明显低于空白转染组(P<0.05)。见表2和图1。

2.52组miR-135a对DU145细胞STAT6表达影响的结果比较 miR-135a转染组p-STAT6和STAT6蛋白相对表达量分别为(0.947±0.114)和(0.437±0.077)，明显低于空白转染组[(1.320±0.104)和(0.783±0.095)](t=-5.757、-6.931，P<0.05)。见图2。

注：1表示 miR-135a转染组；2表示空白转染组

图2 Western blot检测图

3 讨 论

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，包括腺癌、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌等，其中前列腺癌占95%以上[7-8]。随我国老龄化人口的加重，前列腺癌的发病率也逐渐上升，其病死率较高，现已成为危害男性健康的首位肿瘤[9]。前列腺癌的具体发病原因和机制尚不完全清楚，一般认为与遗传因素有关；且前列腺癌多侵袭膀胱、精囊、血管神经束等，并可通过盆腔淋巴结转移引起双下肢水肿，部分患者还会发生骨转移，给临床治疗造成难度[10-11]。miRNA是一类重要的内源性单链非编码小RNA分子，可调控细胞生物的发育、增殖、分化、代谢、凋亡、应激等过程，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因表达进行负调控，导致mRNA的降解和翻译抑制[12]。越来越多的研究表明，miRNA与肿瘤的发生、发展等过程密切相关，但目前对于miRNA在前列腺癌中的发病机制研究较少[13]。miR-135a是miR-135家族的重要成员之一，具有促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用，其在多种肿瘤的发生、发展中发挥了重要的调控作用。有研究报道，miR-135a促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用是通过对JAK2(Janus kinase 2)及相关通路(JA-STAT)的调控而实现，但具体机制仍需作进一步的研究[14]。

本研究结果表明，转染48 h后miR-135a转染组miR-135a相对表达量明显高于空白转染组(P<0.05)，提示miR-135a转染组细胞miR-135a明显高表达。通过MTT检测细胞增长率发现，miR-135a转染组培养24、48 h的OD值明显低于空白转染组(P<0.05)，提示miR-10a高表达可抑制肿瘤的增长。通过流式细胞仪测定细胞周期显示，miR-135a转染组G0/G1期细胞比例为明显高于空白转染组(P<0.05)，说明miR-135a可显著地阻滞DU145细胞周期，进一步抑制肿瘤细胞的增长。侵袭实验发现，miR-135a转染组迁移细胞数和侵袭细胞数分别明显低于空白转染组(P<0.05)，提示miR-135a与前列腺癌细胞的侵袭和迁移高度相关，其高表达可抑制细胞的侵袭和迁移，但其具体机制仍需作进一步的深入研究。

STAT6是一种相对分子质量约为94×103的蛋白质，属于STAT家族，可通过JAK-STAT信号转导途径介导多种细胞因子的活化，进而参与多种疾病的发生和发展。有研究报道，STAT6是miR-135a的潜在靶基因，可能与miR-135a抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭等机制有关，与本研究的研究结果基本一致[15]。本研究结果表明，miR-135a转染组p-STAT6和STAT6蛋白相对表达量均明显低于空白转染组(P<0.05)，说明miR-135a高表达可抑制前列腺癌细胞STAT6蛋白的表达，而这可能是miR-135a抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制之一，但具体机制仍需作进一步的实验。

综上所述，miR-135a可抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的能力，可能与其抑制前列腺癌细胞STAT6表达有关。

参考文献

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