2株芽孢杆菌在棉花根部定殖动态及其对棉苗立枯病的防效

陈虹娇，李怡心，陈文静，姚兆群，曹晓蕾，赵思峰

（新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆 石河子 832003）

新疆是我国最大的优质商品棉基地，然而因棉田布局集中，在主要棉区轮作倒茬实施困难，多年连作导致棉苗烂根病、棉花枯黄萎病等土传病害发生普遍且危害日益严重[1-2]。目前防治作物土传病害的主要方法有农业防治、物理防治、化学防治、生物防治等，各种方法均有其适用范围和优缺点，其中采用浸种、蘸根、灌根、滴灌施用、混土等方式利用生防菌剂防治土传病害已得到广泛应用[3-5]。然而生防菌在植物根际能否有效定殖是生防菌发挥稳定、持久防病效果的一个重要因素，也是筛选、评定土传病害生防菌的一个重要指标，并最终决定该生防菌是否具有产业化前景[6]。肖项政等[7]采用氨苄青霉素抗性标记评价了短小芽孢杆菌BX-4菌株在番茄根部的定殖和对番茄青枯病的防治情况，发现该菌株可长期定殖于番茄根部，对番茄青枯病的防效达40%。邱小燕等[6]采用利福平抗性标记评价了枯草芽孢杆菌515-126菌株在玉米根际的定殖情况及其对玉米纹枯病的防效。黄秋斌等[8]采用绿色荧光蛋白酶（GFP）基因标记评价了蜡样芽孢杆菌B3-7菌株在大田小麦根际的定制动态及其对小麦纹枯病的防治效果，发现该菌株可在小麦根部长期定殖，在小麦分蘖期菌量达到最大，对纹枯病有防效达60%，且具有明显的增产效果。杨洪凤等[9]采用利福平抗性标记结合透射电镜的方法，确定了内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖动态，明确了该菌株能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖，对小麦赤霉病防效达到90.3%，展现出了良好的开发和应用前景。

本实验室前期筛选了Bacillus atrophaeusB44和Bacillus subtilisS37两株菌，经盆栽和田间验证，对棉苗立枯病和棉花黄萎病均表现出良好的防治效果[3-4]，然而其在棉花根部的定殖动态及其与防病效果的关系一直未明确。本研究采用GFP基因标记技术对这2株芽孢杆菌进行荧光标记，并将标记菌株施用到棉花根际，评价其在棉苗根部的定殖动态及其对棉苗立枯病的防效，以期为评价其开发生物农药价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

芽孢杆菌B.atrophaeusB44和B.subtilisS37由本实验室分离、鉴定及保存。

棉花品种为新陆早45号。

带有GFP荧光蛋白标记及卡那霉素和氨苄青霉素双重抗性质粒PGF4412，由中国农业大学植物病理系王琦教授惠赠。

SPA 溶液：（500mL）(NH4)2SO40.2 g，K2HPO4·3H2O 1.4 g，KH2PO40.6 g，柠檬酸三钠二水合物 0.1 g，121℃灭菌 20min。SPB 溶液 ：（500mL） MgSO4·7H2O 0.02 g，121 ℃灭菌 20min。100×CAYE Solution：（100mL）酪蛋白水解物 2 g，Yeast Extract 10 g，121 ℃灭菌20 min。SPI溶液：（100mL） SPA 盐溶液 49 mL，SPB盐溶液 49 mL ，（1%V）Glucose（50%W，115 ℃灭菌 20 min）1 mL，（1%V）100×CAYE 1 mL。SPII溶液：（100mL） SPI 溶 液 98 mL，(1%V)50mmol/L CaCl21 mL，（1%V） 250mmol/L MgCl21 mL。

抗生素氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素（Km），购自北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌感受态细胞制备

参照Gao等[10]和李瑞芳等[11]的方法制备2株芽孢杆菌感受态细胞。从-70℃冰箱取出保存菌株，在LB板上划线，37℃培养过夜进行活化，挑取单菌落接种于5mL的SPI溶液，在37℃，200 r/min下摇培过夜，随后按10%的接种量，再次转接于10mL的SPI溶液，在37℃，200 r/min下摇培3.5 h后，取全部10mL培养液转接于90mL的SPII溶液，在37℃，100 r/min下摇培90min，随后在冰上静置10min后，在4℃ 8000 r/min离心5min收集菌体，并用10mL的SPII溶液重新悬浮菌体，即为感受态细胞。将感受态细胞加入50%的甘油至10%后，按每管500 μL分装到离心管中，存入-70℃冰箱，待用。

1.2.2 抗性筛选平板抗性浓度的筛选

为提高芽孢杆菌的转化率，首先对B44和S37菌株进行抗性浓度筛选，以确定转化时需使用的抗性平板最适浓度。分别配置浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素和卡那霉素溶液。倒板前在200mL的LB培养基中，分别加入2种不同的抗生素，使氨苄青霉素和卡那霉素的终浓度均分别为10 μg/mL，并以5 μg/mL递增至30 μg/mL的浓度，每种抗生素均设置5个浓度梯度。随后分别取未转化的B44和S37感受态细胞进行空转对照，在37℃，200 r/min下摇培2 h，各取200 μL分别涂布于不同抗生素，以及不同浓度梯度的LB平板上，记下菌落生长情况。

1.2.3 2株芽孢杆菌的转化及验证

取出保存的感受态B44和S37菌株，置于冰上放置5min，待感受态为溶融状态，分别加入0.5 μg的质粒PGF4412后混匀，在冰上放置2 min左右，取出在37℃，200 r/min下摇培90min后，涂布于不同抗性的平板，恒温37℃培养过夜。

挑取在抗性平板上长出的单菌落，通过引物G1/G2进行PCR验证质粒是否转化成功，用Ra/Rb验证分别验证B44和S37，并送去测序后与原菌比对，确定其仍分别为芽孢杆菌B44和S37，并在抗性LB液中摇培后，在荧光显微镜下观察荧光标记效果表现。

表1 本试验采用的引物对Tab.1 Primers used in this experiment

1.2.4 标记菌株的稳定性测试

参照郝慧娟等[12]的方法，挑取PCR验证后的单菌落在抗性LB液中摇培过夜后，以0.1%接种量，接种于无抗生素LB液中，在37℃ 200 r/min下摇培7 h，随后再以0.1%接种量，接种于新的无抗生素LB液中，于同样条件培养，如此重复7次。然后涂布无抗性LB平板，37℃、200 r/min培养过夜后，随机取100个菌落，在抗性平板上划线，以荧光菌株所占百分比计算标记菌株的遗传稳定性。

1.2.6 标记菌株在棉苗根部定殖量及其对棉苗立枯病的防效

棉花种子在15%的双氧水中浸泡30min，然后在无菌水中浸泡8 h后，置于培养皿中，在黑暗条件下放置24 h催芽，直至棉籽露白。将立枯丝核菌菌丝混匀到灭菌蛭石中，湿热条件下培养24 h，待菌丝均匀长满蛭石后，按照1∶1000的质量比混匀到灭菌营养土中，分装到营养钵中待用。

将2种芽孢杆菌液稀释至1×107CFU/mL，并将GFP标记的2株芽孢杆菌菌液分别稀释至1×106、1×107和 1×108CFU/mL，随后各取上述菌液100mL以及无菌水分别润湿蛭石，并在每个营养钵中放置10-15颗露白种子，在其表面覆上一层灭菌营养土，进行盆栽实验，每种处理重复3次。1 d后取芽或根际周围土壤1 g，用抗性平板回收标记菌株，计算菌株在根际土壤的定殖量，并在每隔5 d取样1次，直至30 d。待出芽种子露苗，计算出苗率，同样取根系1 g，通过抗性平板回收标记菌株，计算菌株在棉苗根表的定殖量，直至出苗25 d后，统计棉苗的病情指数，计算相对防效。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100；

相对防效（100%）=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

1.2.7 数据结果与统计

用SPSS统计分析软件对所得数据进行分析，用Excel制图。

2 结果与分析

2.1 抗性平板的浓度筛选

试验结果表明，未标记菌株B44在氨苄青霉素的终浓度达到15 μg/mL时，未长出菌落，而S37菌株在20 μg/mL时未长出菌落。卡那霉素终浓度达到20 μg/mL时，未标记芽孢杆菌B44未长出单菌落，S37菌株在25 μg/mL浓度时未长出单菌落。

2.2 标记菌株的获得与荧光检测

分别挑取在氨苄青霉素抗性平板和卡那霉素抗性平板长出的单菌落进行PCR验证，只有在氨苄青霉素抗性板上长出的转化子是成功标记的菌株。对成功标记的菌株B44和S37的进一步测序结果也表明转化成功的标记菌株是B.atrophaeusB44和B.subtilisS37（见图1D）。B44菌株在氨苄青霉素抗性板上长出的转化子，原有褶皱丢失（图1B），而芽孢杆菌S37长出的转化子表面变得光滑半透明，不再有皱缩以及隆起的白色状物（图1A）。

图1 标记菌株形态Fig.1 Morphology of the marked Bacillus

2.3 标记菌株的遗传稳定性评价

由图2可见，在无抗性选择压力存在条件下，随着传代次数增加，标记菌株的质粒部分丢失，GFP标记的遗传稳定性逐渐下降。连续稀释培养50 h后，S37与B44遗传稳定性分别为82%和71%，可以满足后续试验条件。

图2 标记菌株的到遗传稳定性Fig.2 Stability of the marked bacillus

2.4 2株芽孢杆菌在棉花根际定殖情况

通过荧光显微镜发现GFP标记的菌株B44与S37均仅能在棉花根表定殖，但仅在表层粘附，在棉花的根内没有检测到标记菌株（图3）。第7和14天检测结果与第3天一致，2株菌均只定殖于棉花根表面。

图4 标记菌株在根际土壤的定殖量Fig.4 Colonization dynamics of the marked strains on rhizosphere soil

图3 标记菌株在棉花上的定殖Fig.3 Colonization of marked strains on cotton root

2.5 2株芽孢杆菌在棉花根际土壤及根表的定殖动态变化

结果如图4。

图5 标记菌株在棉花根表的定殖Fig.5 Colonization dynamics of the marked strains on surface of cotton roots

由图4可见，两株菌在根际土壤及根表的定殖量不仅与菌的种类相关，也与初始浓度相关。B44在初始浓度为 1×106、1×107和 1×108CFU/g时，30 d后，土壤中的菌量分别为 1.4×105、8.8×105和4.24×106CFU/g，而其在根表的定殖量分别为9.7×103、1.45×104和 1.43×104CFU/g。S37 在根际土壤中的定殖量相对高于B44，30d后其在土壤中的菌量分别为 4.3×105、1.26×106和 7.1×106CFU/g，而其在根表的定殖量分别为 9.8×103、2.35×104和2.74×104CFU/g，与 B44相差较小（图 5）。2株芽孢杆菌均在表现为随着初始接菌量增加，后期定殖量相比越大。

2.6 不同浓度转基因芽孢杆菌对棉苗立枯病的盆栽防效

由表2可见，GFP基因标记后的芽孢杆菌S37和B44其防病效果与野生型差异不明显，野生型菌株S37和B44在1×107CFU/mL时，其对棉苗立枯病的防效分别为33.2%和25.4%，而GFP-S37和GFP-B44的防效为30.1%和29.1%。通过盆栽试验也发现，2株芽孢杆菌对棉苗立枯病的防效与其定殖量有关，其中GFP-S37初始接种浓度为1×108CFU/mL时，防效达到了51.7%，表现出了良好的防病效果。

表2 2株芽孢杆菌对棉苗立枯病的防效Tab.2 Control effect of two Bacillus on cotton Rhizoctoniosis

3 讨论

对芽孢杆菌进行GFP标记，并观察其在作物上的定殖情况，在很大程度上促进了对芽孢杆菌与寄主作物、环境之间相互作用的研究。有研究表明有的芽孢杆菌能够定植于作物内部[13-15]，而有些菌仅在作物根际或根表以及根围等定殖[16-18]。本研究中，2株芽孢杆菌仅在棉花根外表的粘附定殖，在棉花根内部未检测到标记菌株的存在。就芽孢杆菌本身而言，其不同种之间的菌体大小差异并不显著，造成定殖位置差异的主要因素应与宿主体表分泌物与芽孢杆菌的互作相关[20]。

不同的芽孢杆菌在作物上的定殖量也不同，张德涛等[19]将芽孢杆菌NB12以3×1010CFU/mL的浓度喷洒到水稻后，检测发现其在接种水稻7 d，直至20 d时的定殖菌量高达106CFU/g，其对水稻纹枯病的防效也高达91.3%。黄秋斌等[8]用1×109CFU/mL浓度的蜡样芽孢杆菌B3-7灌根接种小麦，发现其在小麦根上的定殖量能达到105CFU/g，其对小麦纹枯病有较好的防治效果（60%）。这说明初始接种量越高，其定殖量越多，防效较好。本试验中，当接种B44浓度为1×106CFU/mL时，在发芽种子出苗25 d时，其在棉花根际土壤的定殖量为1.4×105CFU/g，在棉花根表的定殖菌量基本稳定在9.7×103CFU/g，其对棉苗立枯病的防效为21.7%。接种浓度为1×107CFU/mL时，相同时间周期后，其在棉花根际土壤的定殖量为4.24×106CFU/g，在棉花根表的定殖菌量稳定在1.43×104CFU/g，其对棉苗立枯病的防效为34.5%。同样，S37也表现出初始菌量越高，定殖量越高，防病效果越高的趋势。

4 结论

本试验通过Spizizen法，以及对抗性浓度的筛选，成功将质粒PGF4412分别转化进芽孢杆菌B.atrophaeusB44和B.subtilisS37进行标记，标记菌株的遗传稳定性较好，并且这2株芽孢杆菌均只能在棉花根表定殖，芽孢杆菌在棉花根际土壤以及根表的定殖量与其对棉苗立枯病的防效成正比，因此，2株菌具有良好的开发前景。

[1]韩剑，张静文，徐文修，等.新疆连作、轮作棉田可培养的土壤微生物区系及活性分析[J].棉花学报，2011，23(1):69-74.Han J，Zhang J W，Xu W X，et al.Dynamics analysis of culturablesoil microflora and microbial activity in continuous and rotation cropping systems of cotton in Xinjiang[J].Cotton Science，2011，23(1):69-74.

[2]万刚，刘振海，苏景惠，等.持续高温与棉花黄萎病发生的关系及对棉花产量和品质的影响[J].石河子大学学报(自然科学版)，2017，35(1):75-82.Wan G，Liu Z H，Su J H，et al.The relationship between continuous high temperature and the occurrence of cottonVerticillium wiltand its effect on yield and quality of cotton[J].Journal of Shihezi University(Natural Science)，2017，35(1):75-82.

[3]曹坳程，刘晓漫，郭美霞，等.作物土传病害的危害及防治技术[J].植物保护，2017，43(2):6-16.Cao A C，Liu X M，Guo M X，et al.Incidences of soilborne diseases and control measures[J].Plant Protection，2017，43(2):6-16.

[4]罗燕娜，杜娟，李俊华，等.滴灌条件下枯草芽孢杆菌S37和S44对棉花黄萎病的防治效果 [J].植物保护，2011，37(2):174-176.Luo Y N，Du J，Li J H，et al.Control efficacy ofBacillus subtilisS37 and S44 against cottonVerticillium wiltby under-mulch-drip irrigation[J].Plant Protection，2011，37(2):174-176.

[5]何艳慧，武占省，凃亮，等.SRPG-396菌株的溶磷能力及其对棉花的促生效果[J].石河子大学学报(自然科学版)，2016，34(1):12-17.He Y H，Wu Z S，Tu L，Phosphate solubilizing ability of SRPG-396 strain and its growth promoting effect on cotton[J].Journal of ShiheziUniversity(Natural Science)，2016，34(1):12-17.

[6]邱小燕，张，敏，胡晓，等.枯草芽孢杆菌的定殖能力及对玉米纹枯病的防治效果[J].四川农业大学学报，2010，28(4):492-496.Qiu X Y，Zhang M，Hu X，et al.Colonization ability ofBacillus subtilisand its protective effect against Rhizoctoniasolani[J].Journal of Sichuan Agricultural University，2010，28(4):492-496.

[7]肖相政，刘可星，廖宗文.短小芽孢杆菌BX-4抗生素标记及定殖效果研究[J].农业环境科学学报2009，28(6):1172-1176.Xiao X Z，Liu K X，Liao Z W，et al.Ampicillin-resistantBacillus pumilusBX-4 and its colonization in the tomato rhizosphere[J].Journal of Agro-Environment Science，2009，28(6):1172-1176.

[8]黄秋斌，张颖，刘凤英，等.蜡样芽孢杆菌B3-7在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果[J].生态学报，2014，34(10):2559-2566.Huang Q B，Zhang Y，Liu F Y，et al.Colonization dynamics ofBacillus cereusB3-7 on wheat roots and control efficiency against sharp eyespot of wheat[J].Acta Ecologica Sinica，2014，34(10):2559-2566.

[9]杨洪凤，余向阳，薛雅蓉，等.内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果[J].中国生物防治学报，2014，30(6)：839-844.Yang H F，Yu X Y，Xue Y R，et al.Colonization of endophyticBacillus amyloliquefaciensCC09 in wheat roots observed under transmission electron microscopy and its biocontrol efficiency against diseases[J].Chinese Journal of Biological Control，2014，30(6)：839-844.

[10]Gao C，Xue Y，Ma Y.Protoplast transformation of recalcitrant alkaliphilicBacillus sp.with methylated plasmid DNA and a developed hard agar regeneration medium[J].PloSone，2011，6(11)：e28148.

[11]李瑞芳，薛雯雯，黄亮，等.枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究[J].生物技术通报，2011（5）:227-230.LiR F，Xue W W，HuangL，et al.Competent preparation and plasmid transformation ofBacillus subtilis[J].Biotechnology Bulletin，2011（5）:227-230.

[12]郝慧娟，刘洪伟，尹淑丽，等.枯草芽孢杆菌 BSD-2的 GFP标记及其在黄瓜上的定殖研究 [J].华北农学报，2016，31(4):106-111.Hao H J，Liu H W，Yin S L，et al.GFP-Marking and colonization on cucumber ofBacillus subtilisBSD-2[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2016，31(4):106-111.

[13]Batista B D，Lacava P T，Ferrari A，et al.Screening of tropically derived，multi-trait plant growth-promoting rhizobacteria and evaluation of corn and soybean colonization ability[J].Microbiological Research，2018，206（7）:33-42.

[14]乔俊卿，陈志谊，梁雪杰，等.枯草芽孢杆菌 Bs916在番茄根部的定殖[J].江苏农业学报，2015，31(6):1278-1283.Qiao J Q，Chen Z Y，Liang X J，et al.Colonization ofBacillus subtilisBs916 on tomato root[J].Jiangsu J of Agr Sci，2015，31(6):1278-1283.

[15]Lin Q，Zhu P，Carballar-Lejarazu R，et al.The colonization of strains in bryophytes[J].Turkish Journal of Biology，2017，41(1):41-48.

[16]田涛，亓雪晨，王琦，等.芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探[J].植物病理学报，2004，34(4):346-351.Tian T，Qi X C，Wang Q，et al.Colonization study of GFP-tagged Bacillus strains on wheat surface[J].Acta Phytopathologica Sinica，2004，34(4):346-351.

[17]Han T，You C，Zhang L，et al.Biocontrol potential of antagonistBacillus subtilisTpb55 against tobacco black shank[J].Bio Control，2016，61(2):195-205.

[18]Li S，Zhang N，Zhang Z，et al.AntagonistBacillus subtilisHJ5 controlsVerticillium wiltof cotton by root colonization and biofilm formation[J].Biology and Fertility of Soils，2013，49(3):295-303.

[19]张德涛，彭正凯，曹琦琦，等.3株拮抗菌在水稻植株上的定殖能力及对纹枯病的防效 [J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2012，40(2):97-102.Zhang D T，Peng Z K，Cao Q Q，et al.Colonization of three antagonistic strains on rice plant and their biocontrol effects on rice sheath blight[J].Journal of Northwest A＆F University(Nat Sci Ed)，2012，40(2):97-102.

[20]张楠.根际有益芽孢杆菌N11及SQR9与植物根系的互作研究[D].南京：南京农业大学，2012.