某院结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征

刘厚明，陈 珊，黄莎莎，单万水

(1 深圳市第三人民医院，广东 深圳 518112；2广东医科大学，广东 湛江 524002)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的一种对人类健康危害严重的慢性传染病。2015年全球新增结核病例1 040万，新增耐多药结核病例48万，超半数来自印度、中国和俄罗斯[1]。结核病是2016年传染性疾病中排名第一的死亡原因[2]。我国现有427万活动性肺结核患者，是全球30个结核病高负担国家之一，新发结核病病例位居全球第三，新增耐多药结核患者数居全球第二[3]。耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是指结核病患者感染的MTB至少同时对利福平(rifampicin, RFP)和异烟肼(isoniazid, INH)产生耐药性[4]。2015年我国每10位结核病患者中仅有3位得到准确诊断，每100位MDR-TB患者仅有5位获得有效治疗[5]。目前，快速检测MTB耐药相关基因的方法在全球范围内日益增多，国内各地区积极开展研究地区耐药基因突变特征，以期获得快速分子检测信息。本研究通过基因测序法分析结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB和INH耐药相关基因katG、inhA启动子的突变情况，探讨某院耐药结核分枝杆菌临床分离株ropB、katG 和inhA 基因突变特征及其与耐药性的相互关系，为新兴MDR-TB分子诊断技术在本地区的应用提供理论支撑，也为该院制定耐药结核病防治规划提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2012年8月—2014年5月某市传染病专科医院住院患者送检痰标本分离培养的MTB 83株，菌株来源包括新发和复发患者，年龄为15～77岁；男性56例，女性27例。所有MTB DNA标本均保存于-70℃冰箱并统一进行相关耐药基因突变位点检测。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株分离鉴定及药敏试验 严格按照国家结核病细菌学检验标准化规程进行试验，标本用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪培养，培养阳性的菌株进行抗酸染色，利用实时荧光定量PCR进行菌种鉴定。采用世界卫生组织(WHO)推荐的比例法对RFP、INH、链霉素和乙胺丁醇进行敏感性试验，4种药物在培养基中的临界浓度分别为1、0.1、1和5 mg/L，根据待测管与空白对照管中分枝杆菌的生长情况对比判断该药的敏感性，结果判读为耐药(R)或敏感(S)。

1.2.2 细菌DNA的制备 吸取一定量的液体培养基中生长的MTB，在80℃恒温箱中灭活60 min，使用 Qiagen公司的细菌基因提取试剂盒提取基因组DNA，操作按说明书进行。

1.2.3 引物设计与合成 通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/的genebank获得标准株H37RvrpoB、katG和inhA基因全序列，采用primer premier 5.0设计引物，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.4 目的基因的扩增与测序 PCR反应体积为50 μL，包括3 μL模板，5 μL 10× LA PCR Buffer II，2.5 μL引物，8 μL dNTP混合液，0.5 μL Taq PCR master mix，31 μL去离子水。扩增条件： 94℃变性1 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃210 s，30个循环；72℃延伸7 min。PCR产物送华大基因公司进行纯化和测序，测序结果与MTB标准株H37Rv序列比对分析。

1.3 统计分析 应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计数资料采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果 收集的83株MTB临床样本中，耐药株60株，全敏感株23株。其中RFP耐药株39株，敏感株44株；INH耐药株51株，敏感株32株；对RFP及INH同时耐药30株。

2.2 RFP耐药相关基因rpoB的突变特征 39株RFP耐药株中有38株检测到rpoB基因突变，突变率达97.44%(38/39)，其中36株在rpoB基因81bp的基因核心区域内发生突变，2株在1 156位点发生突变。测序结果显示，39株RFP耐药株中共发现19种突变形式，其中9种为本研究新发现的突变类型，主要包括两个以上密码子联合突变、点突变、同一密码子双重突变，未发现碱基插入或缺失。突变菌株中单位点突变有6株(15.79%)，多位点联合突变有32株(84.21%)。最常见的突变位点为531位点，突变率达60.53%(23/38)，变化形式主要由组氨酸(His)突变为亮氨酸(Leu)或酪氨酸(Tyr)；其次的突变位点为526位点，突变率为23.68%(9/38)。44株RFP敏感菌株中有31株检测到突变，其中1 156位点同义突变占80.65%(25/31)。见表2。

表2 83株MTB RFP耐药相关基因rpoB突变特征

注：NMa为无基因突变；b为TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库(http://www.tbdreamdb.com)中未报道位点；c为氨基酸同义突变，该位点在TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库中未见报道；突变前后改变氨基酸使用一字码简写；TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库查询日期为2017年7月25日

2.3 INH耐药相关基因katG、inhA的突变特征 98.04%(50/51)的INH耐药株在katG基因出现突变，其中14株为单位点突变，36株存在多位点联合突变。14株单位点突变菌株中，有8株为katG 315位点突变；36株多位点联合突变菌株中，有27株为katG 315位点突变；katG 315位点突变率为70.00%(35/50)。32株INH敏感菌株中未发现katG 315位点突变。katG 463位密码子在耐药株和敏感株中均检测到突变，突变率分别为74.51%(38/51)、59.38%(19/32)，两者突变率比较，差异无统计学意义(χ2=2.09，P=0.15)。51株INH耐药株中仅1株检测到inhA 21位点突变，且为inhA 21位点与katG 463位点联合突变，其余50株分离株inhA 21位点基因序列与标准株H37Rv序列均一致；INH敏感株未检测到inhA 21位点基因突变。见表3。

表3 83株MTB分离株katG、inhA基因突变情况

*：为inhA基因上的密码子；NMa为无基因突变；b为TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库(http://www.tbdreamdb.com)中未报道位点；c为氨基酸同义突变，该位点在TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库中未见报道；突变前后改变氨基酸使用一字码简写；TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库查询日期为2017年7月25日

3 讨论

21世纪以来，随着耐药MTB的出现和传播，全球结核病疫情呈现死灰复燃的态势，耐药结核病患者尤其是耐多药及广泛耐药性结核病患者逐年增加，给公共卫生安全带来严重威胁。INH和RFP作为目前使用最广泛的一线抗结核药物，在MTB耐药谱中高居前2位[6]，而INH和RFP较高耐药率的出现，主要与其耐药基因突变相关[7]。全国各地区关于MTB耐RFP和INH相关基因的突变频率存在差异，因此，以地区为单位研究MTB耐药基因的突变特征对各地区开展结核病防治工作有重大意义。

rpoB是MTB RNA聚合酶β亚单位的编码基因，长约3 534 bp，编码1 178个氨基酸。大量研究[8-9]表明，90%～97%耐RFP的MTB是由rpoB基因内的RFP耐药基因核心区(rifampicin resistance determining region，RRDR)发生突变引起。本研究结果显示，83株MTB中有39株出现RFP耐药，RFP耐药率为46.99%，耐RFP菌株中检测到rpoB基因RRDR区域内突变36株，突变率达92.31%(36/39)。本研究中不计入同义突变类型，最常见的突变位点是531、526位点，突变频率分别为60.53%(23/38)和23.68%(9/38)，两位点突变频率之和占84.21%(32/38)；其中531位点突变频率高于湖南报道的51.1%[10]和江苏报道的55.4%[11]，低于新疆地区报道的73.6%[12]，说明地区间rpoB 531突变频率存在一定差异。此外，发现有3株菌在RRDR区内出现双碱基突变，以rpoB 511和516位点、rpoB 516和526位点以及rpoB 526和533位点联合突变的形式存在，考虑可能rpoB 511、516和533位点突变与RFP低浓度耐药有关[13]。RRDR区域外发现2个同义突变位点D382D和A1156A，可能与RFP耐药无关[14]。本研究还检测到10个未被TBDReaMDB结核分枝杆菌数据库收录的E162G、T240P、G317D等位点，这些位点以与RRDR区的rpoB 531、526、516、511等位点联合突变的形式存在，分析这种联合突变类型中RRDR区的突变位点可能对MTB耐RFP起主导作用，区域外与之联合突变的位点与RFP耐药的相关性并不明确，也许有协同作用，也可能与RFP耐药无关，尚待日后研究。本研究中发现MTB耐RFP以rpoB 531位点突变为主，其次是526位点，与2012年广东地区报道[15]rpoB基因突变特征相似，说明检测此两位点存在突变与否可以作为该地区MTB对RFP耐药性的分子诊断依据。

INH是前体药物，通过被动扩增进入MTB菌体内，能抑制细胞壁分枝菌酸的合成，从而破坏其完整性以达到杀菌目的。INH耐药机制复杂，涉及katG酶、烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)、β-酮酰基运载蛋白合成酶(kasA)、烷基过氧化氢还原酶(ahpC)和还原型辅酶I脱氢酶(ndh)等基因。据研究报道， 85%以上INH耐药株存在katG基因和inhA-15位点突变[16-18]。本研究中，83株MTB菌株有51株耐INH，耐药率为61.45%，检测到katG基因序列突变为50株，突变率为98.04%(50/51)，仅1株检测到inhA突变，表明katG基因突变与INH耐药相关。本次测序结果显示，katG 315位点突变率为70.00%(35/50)，且存在katG 315突变的均为INH耐药株，说明在该院可将katG 315突变作为快速检测MTB对INH耐药性的一个可靠标志。同时，INH耐药株中还检测到katG基因P100T、V196I、W191G 等8个未被TBDReaMDB结核菌数据库收录的突变位点，除多态性位点、同义突变和联合突变，W191G、A264V、P325S、Y608D、G490D、N508D位点均属单碱基有效突变，以上位点可能与INH耐药相关，但需更多数据和相关研究证实。

inhA 基因最常见的突变位点是inhA-15和inhA-8位点，inhA 启动子突变被证实与INH 低浓度耐药相关[19]。本实验中仅1株出现inhA基因突变，占突变株的2.00%(1/50)，低于Zhou等[20]的研究结果，与Tseng等[21]的研究结果相似，由此推测耐药株中inhA基因突变具有地域差异性，在该院inhA基因的突变频率偏低，但也不排除是因样本量较少所致。除此之外，本实验在INH耐药株和敏感株中均检测到katG 463(CGG-CTG)突变，据报道katG463突变是自然存在的基因多态性位点，与INH耐药性无关[22]。

本实验采用BD MGIT 960 RISE比例法和DNA测序法对本院耐RFP和INH的MTB相关基因的突变情况进行分析，发现30株耐多药菌株均发生rpoB和katG基因联合突变，说明rpoB和katG基因存在协同作用，同时发生突变可导致MTB对RFP和INH产生耐药，且有报道[23]指出90%～95%耐RFP的MTB菌株同时耐INH，单独对MTB进行RFP耐药性分析可初步鉴定MDR-TB 。另外，61株耐药株中仍有2株未检测到相关基因突变，提示这些菌株的突变点可能出现在本实验扩增的相关基因区域外，或是由其他耐药机制引起，比如异源性耐药等。一些MTB耐药基因突变位点与表型耐药之间的关系并不十分明确，仍需继续研究以提高基因检测的特异性和灵敏度。

总之，MTB耐药基因突变情况存在地域差异，可能受样本量大小和抽样方式、人群遗传背景、菌株进化背景以及环境等因素影响。医院可通过筛检rpoB基因的RRDR区域、katG基因高频突变点作为初步快速判断耐多药MTB耐药性的方法之一。

[参 考 文 献]

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