PTEN在动脉粥样硬化中的表达及对血管内皮细胞增殖凋亡的影响研究

闫博阳 赵津璋 陈 虹

(黑龙江省佳木斯市中心医院,佳木斯 154002)

动脉粥样硬化是一种常见的心血管系统疾病，也是多种心脑血管疾病发生的基础，血管内皮细胞(Vascular endothelial cell，VEC)和平滑肌细胞受损是动脉粥样硬化发生的重要原因，其受损后可以引发血管内膜增生、斑块沉积等现象[1,2]。研究表明，动脉粥样硬化的发生与细胞凋亡有关，而VEC凋亡在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用，VEC大量凋亡会引起单层内皮通透性增加，导致平滑肌细胞、单核细胞进入到内膜，损害血管，形成斑块[3,4]。

第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromo-some 10，PTEN)具有双特异性的磷酸酶活性，能够调控细胞的生长、凋亡等过程，并且在癌症发生、心肌缺血再灌注、心肌肥厚等疾病发生过程中也具有调控作用，对于血管内皮细胞生物学行为、心脏发育、胰岛素信号转导等具有重要意义[5,6]。研究显示，ox-LDL刺激后的VEC中PTEN表达下调，参与动脉粥样硬化的发生[7]。为了明确PTEN在动脉粥样硬化组织中的表达，探讨PTEN在VEC增殖凋亡中的作用，本研究构建动脉粥样硬化小鼠模型，并通过体外分离培养大鼠VEC，以期为研究动脉粥样硬化发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 20只ApoE-/-小鼠，雄性，6～8周龄，体重18～20 g，购自南京君科生物工程有限公司；SD雄性大鼠8只，6周龄，体重160～180 g购自佳木斯大学动物实验室；PTEN和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPD-H)引物均由南京金斯瑞合成；Real time-PCR试剂盒、cDNA合成试剂盒购自大连TaKaRa；RNA提取试剂盒购自北京TIANGEN；蛋白提取试剂盒购自上海 BestBio；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白提取试剂盒购自美国Biomiga ；氧化低密度脂蛋白(Cu-oxidized LDL，ox-LDL)购自北京索莱宝；鼠尾胶原购自美国Sigma；磷酸化的STAT3(p-STAT3)一抗、信号转导与转录因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)一抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、PTEN一抗均购自美国Abcam；GAPDH一抗购自美国Santa Cruz；Lpofectamine 2000购自美国Invitrogen。

1.2方法

1.2.1动脉粥样硬化小鼠模型构建 ApoE-/-小鼠20只随机分为两组，每组10只，分别为实验组和对照组。实验组小鼠用高脂饲料(含有1%胆固醇和15%猪油)饲喂。对照组用正常的饲料饲喂。两组小鼠均不限制饮水，饲养时间为12周。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 ml/kg)，取实验组小鼠的动脉粥样硬化组织和对照组的正常动脉组织检测PTEN水平。

1.2.2Real time-PCR检测组织中PTEN水平 取动脉粥样硬化组织和对照组的正常动脉组织，提取RNA，紫外分光光度计检测RNA样品的浓度及纯度。反转录合成cDNA，Real time-PCR检测PTEN水平，内参为GAPDH，以2-ΔΔCt方法计算PTEN表达。PTEN上游引物为5′-TCAGACTTTTGTAATTTGTGTATG-3′，下游引物5′-ACAGGCTCCCAGACA-TGACA-3′。GAPDH上游引物为5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物5′-TGAGGATCCACCA-CCCTGT-3′。程序为：95℃ 15 min；94℃ 15 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。

1.2.3Western blot检测组织中PTEN水平 取动脉粥样硬化组织和对照组的正常动脉组织，提取组织蛋白，BCA法定量，蛋白与5×Loading buffer以4∶1混合煮沸5 min。每孔中加入40 μg进行电泳，SDS-PAGE凝胶用5%浓缩胶和10%分离胶，蛋白还未到达分离胶前用80V电压，到达分离胶后用100V电压。转膜：4℃，250 mA，将蛋白转印至硝酸纤维素膜，转膜时间为90 min。封闭：放在5%牛血清白蛋白中，37℃孵育60 min。一抗孵育：600倍稀释，4℃过夜。二抗孵育：1∶600倍稀释，1∶2 000倍稀释，37℃，90 min。显色以GAPDH为内参，Quantity one分析蛋白水平。

1.2.4VEC分离培养 参照文献[8]，取SD雄性大鼠血管组织，放在DMEM中，在无菌条件下用镊子把血管外的结蹄组织和脂肪组织剥离以后，磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，转移到培养皿中，把血管外翻使血管内膜暴露在外，用灭菌线把血管的两头折入以后结扎，用DMEM反复洗涤内膜，把血管放在0.2%的胶原酶中，在37℃，5%CO2培养箱中培养1 h。用含有20%的DMEM洗涤2次，将血管剪成2 mm2左右的组织块，内膜向下种植到用鼠尾胶原包被过的培养瓶中，加入20%的DMEM，37℃，5%CO2培养箱中培养12 h 后，再加入1 ml的新鲜细胞培养液。观察细胞长满细胞瓶壁以后，加入0.25%的胰蛋白酶消化1 min，1 000×g离心10 min，用20%胎牛血清的DMEM悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中。本次实验所用细胞均为第3代细胞。

1.2.5MTT检测ox-LDL对细胞增殖活性的影响 取上述VEC，以每毫升含有105个细胞接种到96孔细胞培养板中，分别用含有ox-LDL浓度为0、6、12、24、48 μg/ml的细胞培养液培养细胞，每个浓度梯度设置5复孔。每孔中加入200 μl的细胞培养液，培养48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液孵育4 h。将上清液吸除后，加入二甲基亚砜溶液150 μl，混合后，酶标仪490 nm检测吸光度(Absorbance，A值)。计算细胞存活率。以0 μg/ml ox-LDL作用组为对照，计算细胞存活率，细胞存活率=(ox-LDL作用组A值÷对照组A值)×100%。实验重复3次，取均值。

1.2.6细胞分组及转染 VEC分为对照组、ox-LDL组、PTEN组，对照组和ox-LDL组细胞转染对照载体(pSicoR)。PTEN组细胞转染PTEN过表达载体(pSicoR-PTEN)，步骤参照Lipofectamine 2000转染试剂。转染后ox-LDL组、PTEN组分别用含有24 μg/ml的ox-LDL的细胞培养液培养细胞，对照组细胞用不含ox-LDL的细胞培养液培养。培养48 h ，用Real time-PCR和Western blot法检测PTEN表达水平，步骤参照1.2.2和1.2.3，同时用MTT法检测各组细胞培养48 h的存活率，步骤同1.2.5。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡 对照组、ox-LDL组、PTEN组细胞分别按照1.2.6中处理后，培养48 h，胰蛋白酶消化细胞，用冰预冷的PBS将细胞调整为每毫升含有106个细胞，取1 ml的细胞悬浮液，离心，收集细胞沉淀，加入200 μl的结合缓冲液，加入5 μl的碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，室温孵育15 min，加入300 μl的结合缓冲液，在60 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对照组、ox-LDL组、PTEN组细胞培养48 h后，Western blot法检测 p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平，步骤参照1.2.3。

2 结果

2.1PTEN在动脉粥样硬化组织中的表达 结果如图1和表1所示，正常组织和动脉粥样硬化组织中PTEN mRNA水平依次为：1.00±0.12、0.47±0.10。PTEN蛋白水平依次为：0.45±0.06、0.18±0.02。动脉粥样硬化组织中PTEN mRNA和蛋白水平均明显低于正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。动脉粥样硬化组织中PTEN水平下调。

2.2ox-LDL对VEC增殖影响 结果如表2所示，0、6、12、24、48 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率依次为：(100.00±11.52)%、(83.24±6.14)%、(70.41±3.69)%、(51.58±3.75)%、(35.69±2.87)%。6、12、24、48 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率明显低于0 μg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05)。VEC的存活率随着ox-LDL作用浓度的升高而降低。24 μg/ml的ox-LDL刺激后的VEC存活率接近50%，后续选用24 μg/ml的ox-LDL作用于VEC。

2.3各组细胞中PTEN表达水平 结果如图2和表3所示，对照组、ox-LDL组、PTEN组PTEN mRNA依次为：1.00±0.08、0.42±0.03、0.69±0.05，PTEN 蛋白依次为：0.53±0.06、0.17±0.03、0.34±0.02。ox-LDL组细胞中PTEN mRNA和蛋白水平均明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 Western blot检测PTEN在动脉粥样硬化组织中的表达Fig.1 Expression of PTEN in atherosclerosis tissues detected by Western blotNote:1.Normal tissue;2.Atherosclerotic tissue.

TissuemRNAProteinNormaltissue100±012045±006Atherosclerotictissue047±0101)018±0021)

Note：Compared with normal tissues,t1=5.212,t2=7.394,1)P<0.05.

ox⁃LDLconcentration(μg/ml)Cellsurvivalrate(%)010000±115268324±6141)127041±3691)2)24 5158±3751)2)3)48 3569±2871)2)3)4)F46809P0000

Note：Compared with 0 μg/ml,t1=3.195，t2=5.642，t3=9.232，t4=12.261，1)P<0.05;compared with 6 μg/m，t1=2.446，t2=6.036，t3=9.066，2)P<0.05;compared with 12 μg/ml，t1=3.590，t2=6.620，3)P<0.05;compared with 24 μg/ml，t=3.030，4)P<0.05.

PTEN组细胞中PTEN mRNA和蛋白水平均明显高于ox-LDL组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ox-LDL能够降低VEC中PTEN的表达，转染PTEN过表达载体能够提高VEC中PTEN的水平。

2.4各组细胞增殖凋亡检测结果 如图3和表4所示，对照组、ox-LDL组、PTEN组细胞存活率依次为：(100.00±9.36)%、(49.28±6.71)%、(74.62±5.73)%，细胞凋亡率依次为：(5.85±0.06)%、(44.25±3.28)%、(23.42±2.54)%。ox-LDL组细胞存活率明显低于对照组，而凋亡率明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。PTEN组细胞存活率明显高于ox-LDL组，而凋亡率明显低于ox-LDL组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ox-LDL促进VEC凋亡，抑制VEC增殖，而PTEN能够减缓ox-LDL对VEC增殖凋亡的作用。

图2 Western blot检测ox-LDL刺激后细胞中PTEN表达Fig.2 PTEN expression detected by Western blot in cells after ox-LDL stimulation

GroupsmRNAProteinControlgroup100±008053±006ox⁃LDLgroup042±0031)017±0031)PTENgroup069±0052)034±0022)F7735729571P00000000

Note：Compared with the control group,t1=12.429，t2=10.910，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=6.643，t2=5.758，2)P<0.05.

图3 流式细胞术检测细胞凋亡情况Fig.3 Cell apoptosis detected by flow cytometry

2.5p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平检测结果 如图4和表5所示，对照组、ox-LDL组、PTEN组细胞p-STAT3水平依次为：0.85±0.08、0.32±0.03、0.58±0.04，细胞STAT3水平依次为：2.11±0.25、2.13±0.21、2.12±0.20，细胞Cleaved Caspase-3水平依次为：0.28±0.04、2.05±0.16、0.82±0.06。ox-LDL组细胞p-STAT3水平明显低于对照组，而Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。PTEN组细胞p-STAT3水平明显高于ox-LDL组，而Cleaved Caspase-3水平明显低于ox-LDL组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

GroupsSurvivalrate(%)Apoptosisrate(%)Controlgroup10000±936585±006ox⁃LDLgroup4928±6711)4425±3281)PTENgroup7462±5732)2342±2542)F34981193204P00010000

Note：Compared with the control group,t1=8.364，t2=19.634，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=4.186，t2=8.983，2)P<0.05.

图4 Western blot检测p-STAT3、STAT3、Cleaved Caspase-3水平Fig.4 p-STAT3,STAT3,Cleaved Caspase-3 levels detected by Western blot

Groupsp⁃STAT3STAT3CleavedCaspase⁃3Controlgroup085±008211±025028±004ox⁃LDLgroup032±0031)213±021205±0161)PTENgroup058±0042)212±020082±0062)F 710230006181724P 000009940000

Note：Compared with the control group,t1=11.918，t2=17.768，1)P<0.05;compared with ox-LDL group,t1=6.071,t2=2.901,2)P<0.05.

3 讨论

人的PTEN基因可以编码403个氨基酸，其含有两个功能结构域，C2区域和磷酸酶区域，磷酸酶结构域调控酶催化过程，而C2区在PTEN与膜脂的结合中发挥关键作用，在PTEN的C端含有能够与PDZ结合的区域，是PTEN与相关支架蛋白结合的重要区域，其还具有自身的去磷酸功能，这些PTEN的结构域和自身特点是其调控细胞生长、凋亡等过程的重要基础[9-12]。研究显示，PTEN在心肌肥大、动脉粥样硬化等心血管疾病中具有调控功能。动脉粥样硬化的发生与细胞免疫炎症、血管内皮细胞凋亡等相关[13,14]。PTEN具有抗炎作用，能够通过调控中性粒细胞的趋化减弱组织炎症，并且能够抑制血管平滑肌细胞的迁移，延缓动脉粥样硬化的发生[15,16]。本研究结果显示，动脉粥样硬化小鼠中PTEN表达水平下降，PTEN可能与动脉粥样硬化的发生有关。

动脉粥样硬化的发生不仅与平滑肌细胞、免疫细胞等有关，其中VEC也参与动脉粥样硬化的发生[17]。研究显示，动脉粥样硬化与细胞的大量凋亡有关，VEC大量凋亡可以引起VEC数量急剧减少，引起单层内皮通透性发生改变，平滑肌细胞和单核细胞迁移到内膜后，造成内膜损伤，VEC凋亡是动脉粥样硬化发生的早期事件[18-21]。本研究通过体外分离培养大鼠VEC，用ox-LDL处理后发现PTEN的表达水平也明显下调，与动脉粥样硬化组织中检测结果相符合，PTEN在动脉粥样硬化中表达下调。本研究通过细胞转染的方法提高VEC中PTEN的表达水平，结果发现，过表达PTEN后的VEC经过ox-LDL处理后的细胞增殖活性有所升高，细胞凋亡率有所降低，PTEN抑制ox-LDL对VEC的损伤。

细胞的生长和凋亡与细胞内信号通路的传导有关，是受到多种基因严格调控的过程[22]。STAT3是目前发现的与肿瘤关系最为密切的STAT蛋白家族成员之一，在相关细胞因子的作用下，STAT3磷酸化水平升高，导致STAT3被激活，能够促进细胞的生长[23-25]。Caspase蛋白家族参与细胞凋亡过程，Caspase-3、Caspase-7、Caspase-6等是凋亡执行子，可以通过与底物特应性结合诱导细胞凋亡的发生，而Caspase-3活化后是细胞凋亡不可逆的标志，也是Caspase家族中最为重要的成员之一[26-28]。研究显示，STAT3能够促进VEC增殖，抑制VEC凋亡[29,30]。本研究结果显示，ox-LDL能够抑制VEC中STAT3的磷酸化，而PTEN可提高STAT3磷酸化水平，PTEN可能通过促进STAT3信号通路影响VEC增殖和凋亡。

综上所述，PTEN在动脉粥样硬化组织中表达下调，ox-LDL促进VEC凋亡，抑制VEC增殖，而过表达PTEN可以抑制VEC凋亡，促进VEC增殖，作用机制可能与STAT3信号通路的激活有关。本研究结果为探讨PTEN在动脉粥样硬化中的作用奠定了基础，对研究动脉粥样硬化发病机制具有重要意义。本研究存在一定的局限性，PTEN在血管内皮细胞中的作用机制是否与STAT3有关还需要进一步验证，并且在后续实验中会继续探讨PTEN对其他相关信号通路的作用。

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