Sel1L对小鼠骨髓源树突状细胞的影响①

许 洁 颜楠楠 赵传祥 李 慈 吴 仪 肖腾飞 高凤威 周文慧 邵启祥 龙乔明夏 圣

(江苏大学医学院免疫学与免疫检验学教研室， 镇江 212013)

内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是真核生物加工和折叠蛋白质的重要场所[1]。在此过程中，葡萄糖的缺失、异常的Ca2+调节以及缺氧等都可以影响蛋白质折叠，导致未折叠以及错误折叠的蛋白质在腔内聚集[2]，从而诱导内质网应激(ER Stress)。错误折叠的蛋白质不断积累可以触发未折叠蛋白反应(UPR)。该反应由三个内质网跨膜受体介导，即转录活化因子6(ATF6)、肌醇依赖酶1(IRE1)和蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)。UPR通过上调分子伴侣的表达、减少蛋白质翻译以及诱导ER相关降解作用(ER associated degradation，ERAD)，从而减轻腔内的蛋白质负荷[3-5]。

Sel1L(Suppressor/enhancer of Lin-12-like)是参与ERAD的E3连接酶羟甲基戊二酰基还原酶降解蛋白1(Hrd1)的衔接蛋白。有研究表明，Sel1L基因与多种癌症类型的肿瘤发生、干细胞分化、胰腺上皮细胞分化等有关[6-8]，而人类自身免疫性甲状腺疾病和人类阿尔兹海默病中已鉴定出Sel1L基因的变异[9,10]。然而，Sel1L分子如何调控体内ERAD和ER稳态尚未清楚。

树突状细胞(Dendritic cell，DCs)是机体重要的抗原提呈细胞，在激发免疫应答和诱导免疫耐受两方面均起关键作用。其在分化和发育过程中，有大量蛋白质的合成与折叠，内质网在这一过程中起到重要作用，而Sel1L分子是维持内质网内环境稳态所必不可少的。本研究即利用Cre-Loxp重组系统构建CD11c+Sel1L基因敲除小鼠制备骨髓源树突状细胞，以探究Sel1L对树突状细胞的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 Sel1Lf/f小鼠由苏州大学龙乔明教授惠赠，CD11c-Cre+/-小鼠(JAX 007567)和H2-K b-OVA323-339肽抗原特异性的OTII小鼠(购自Jackson Lab)。实验时，由Sel1Lf/f小鼠与CD11c-Cre+/-小鼠进行交配，产下子代小鼠的基因型经基因型PCR鉴定后，筛选出Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠。所有实验均使用6～12周龄的雌性小鼠，并用野生型同窝小鼠作对照组。

1.1.2主要试剂 RPMI1640 培养基、胎牛血清(PAA公司)，6孔、24孔、96孔细胞培养板(Nunc公司)，总RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光染料(TaKaRa公司)，脂多糖(LPS)、卵清蛋白(OVA)(Sigma公司)，CFSE荧光染料(Invitrogen公司)，RIPA裂解液、PMSF液(碧云天公司)，CD11c-Percp-cy5.5、CD11b-FITC、CD11b-PE、CD80-PE、CD86-PE、MHC-Ⅰ-FITC、MHC-Ⅱ-FITC、CD4-PE(eBioscience公司)，Biotin磁分选试剂盒(Stem cell公司)，兔抗Sel1L抗体(Abcam公司)，β-actin-HRP抗体(Santa Cruz公司)，BCA试剂盒(Thermo公司)；超净工作台(苏州净化厂)，细胞培养箱(Thermo公司)，Western Blot系列设备、PCR仪、CFX96定量PCR仪(Bio-Rad公司)，倒置式生物显微镜(Nikon公司)，BD Accuri C6流式细胞仪、BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪(BD公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的体外培养 参照文献[11]进行。将Sel1Lf/f型(WT)小鼠与Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-型(KO)小鼠分别处死后，取出股骨与胫骨，用无菌PBS液冲洗骨髓腔，制备骨髓细胞。用含10%FCS、GM-CSF(10 ng/ml)、IL-4(1 ng/ml)的RPMI1640培养基将骨髓细胞在37℃、5%CO2条件下培养7 d后，收集并纯化CD11c+细胞，作为未成熟BMDC细胞。经LPS(终浓度1 μg/ml)刺激18 h细胞作为成熟BMDC细胞。

1.2.2Western blot检测BMDCs中Sel1L蛋白的表达 分别将WT型与KO型小鼠诱导培养7 d的BMDC细胞按每孔6×105细胞加入到24孔板中，加入LPS刺激后继续培养18～24 h。收集细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，Western blot检测WT型与KO型小鼠BMDCs中Sel1L蛋白的表达。

1.2.3Sel1L对BMDCs膜表面共刺激分子和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的影响 BMDC细胞的处理与准备同1.2.2。收集细胞，用大鼠血清封闭10 min后，4℃条件下，分别加入荧光素标记MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86，孵育20 min。标记完成后，将细胞用PBS洗2遍后，用流式细胞分析仪检测标记细胞的荧光信号，Flowjo软件分析数据。

1.2.4ELISA法检测上清中细胞因子的分泌 收集WT型与KO型小鼠的BMDCs的培养上清液。按照ELISA试剂盒(eBioscience)的使用说明分别检测上清中IL-6、IL-12p70的含量。

1.2.5实时荧光定量检测Sel1L对BMDCs分泌IL-6、IL-12的影响 BMDC细胞的处理与准备同1.2.2。收集细胞，加入TRIZOL裂解液提取其总RNA。按照逆转录试剂盒说明书将1 μg RNA逆转录为cDNA，以β-actin为内参，以cDNA为模板，定量检测扩增IL-6、IL-12基因的表达。所用引物序列如下：β-actin上游序列TGGCGCTTTTGACT-CAGGAT，下游序列GGGATGTTTGCTCCAACCAA；IL-6上游序列GAGGAGACTTCACAGAGGATAC，下游序列GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG；IL-12上游序列GGTTTGCCATCGTTTTG，下游序列 GGGTCTTTCCAGAGCCT。实时荧光定量 PCR反应体系：SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μl、ddH2O 4.1 μl、上下游引物各0.2 μl、cDNA 0.5 μl，总反应体系10 μl。扩增条件为95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s、39个循环。用2-ΔΔCT法计算相关基因表达。

1.2.6Sel1L对BMDCs激活抗原特异性CD4+T细胞增殖能力的评估 BMDC细胞的处理与准备同1.2.2。将BMDCs用OVA323-339肽孵育6 h。取肽抗原特异性OT-Ⅱ小鼠脾脏，研磨、破红后，用PBS洗一次。去上清，1 ml PBS重悬，将细胞数调整到1×108ml-1转移至分选管中，补加PBS至总体积为1 ml。加试剂盒中FcR blocker 10 μl，加Biotin抗体6 μl，室温15 min；加Biotin Selection Cocktail 100 μl，室温15 min；加Magnetic Particles 50 μl，室温 10 min；补加分选缓冲液至分选管总体积2.5 ml，混匀，将分选管插入分选磁铁中，室温5 min，弃去液体；加缓冲液混匀，再重复分选2次。加PBS吹打混匀细胞，加CFSE(终浓度2.5 μmol/L)于37℃避光孵育10 min。将经OVA孵育的BMDCs用PBS洗1次后，与来自OT-Ⅱ TCR转基因小鼠的CD4+T细胞共培养，二者比例为2×104∶ 2×105，37℃、5%CO2条件下培养4 d后，用荧光抗体CD4-PE标记细胞，用流式细胞仪检测T细胞的增殖情况。

1.3统计学分析 实验数据用GraphPad Prism 6.0软件分析处理。两组之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠BMDCs中Sel1L的表达 如图1所示，在未成熟BMDCs中，KO型小鼠相对于WT型小鼠来说，Sel1L基因几乎不表达，而成熟BMDCs中趋势更明显。说明Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠体内Cre重组酶与Sel1L基因loxp位点结合，实现了Sel1L基因的条件性敲除。

2.2Sel1L对BMDCs增殖效率的影响 从图2的结果可以看出，相对于WT型小鼠，KO型小鼠的CFSE的荧光强度右移，但细胞总数并没有明显差异，说明Sel1L的缺失导致BMDCs的分化增殖效率降低。

2.3Sel1L对BMDCs细胞膜表型的影响 值得注意的是，我们发现在未成熟BMDCs的表面上MHC-Ⅰ轻微升高，而MHC-Ⅱ表达则显著降低。用LPS诱导18 h以后，导致WT型BMDCs中MHC-Ⅱ表达明显增加，但未能升高KO型DC中的MHC-Ⅱ的表达。相比之下，MHC-Ⅰ依旧轻微上调，而CD80、CD86的表达水平并未被Sel1L缺失所改变(如图3)。这表明小鼠中Sel1L的缺失导致BMDCs的MHC-Ⅱ的表达下降。

2.4Sel1L对BMDCs细胞分泌IL-6、IL-12的影响 对未成熟BMDCs与成熟BMDCs进行比较，结果显示，LPS刺激后的成熟DCs分泌更高水平的炎性因子，与此同时，来自KO型小鼠的BMDCs，IL-6以及IL-12p70的mRNA水平明显升高(图4A)。另外，我们又收集了各组DCs的上清液，用ELISA的方法检测了IL-6、IL-12p70的表达水平，从而在蛋白水平上进一步验证了这一结果。

2.5Sel1L增强BMDCs细胞激活抗原特异性CD4+T细胞的增殖 DCs是专职抗原提呈细胞，通过MHC分子与T细胞表面受体相结合，将抗原呈递给T细胞，产生T细胞活化信号，进而诱导其增殖分化。为进一步探究Sel1L的缺失对DCs这一功能的影响，我们将OVA323-339抗原特异性CD4+T细胞进行CFSE标记后，与OVA323-339孵育的成熟BMDCs共培养，分析CD4+T细胞的CFSE荧光强度从而反映CD4+T细胞的增殖情况。当与WT型小鼠BMDCs共培养时，OT-Ⅱ小鼠的CD4+T细胞大量增殖。相反，与KO型小鼠的BMDCs共培养时，OT-Ⅱ小鼠的CD4+T细胞增殖减少。因此，DC中Sel1L基因缺失会削弱CD4+T细胞的激活。见图5。

图1 在树突状细胞中敲除Sel1L基因Fig.1 Targeted disruption of Sel1L gene in DCs

图2 Sel1L基因对BMDCs增殖的影响Fig.2 Effects of Sel1L gene on proliferation of BMDCsNote:Data were shown as significance.

图3 Sel1L基因对BMDCs细胞膜表型的影响Fig.3 Effects of Sel1L gene on phenotype of BMDCs

图4 Sel1L基因对BMDCs细胞因子的影响Fig.4 Effects of Sel1L gene on BMDCs cytokines secretionNote:Data were shown as significance.

图5 Sel1L基因对BMDCs激活抗原特异性CD4+T细胞增殖能力的影响Fig.5 Effects of Sel1L gene on capability of BMDCs in priming OVA specific CD4+T cell proliferation

3 讨论

多种细胞应激可导致内质网功能障碍，并最终导致蛋白质折叠能力和蛋白质折叠负荷之间的不平衡。有报道认为，蛋白质的异常折叠与糖尿病、心肌缺血、心脏肥大、动脉粥样硬化以及心力衰竭等有关[12-14]。内质网应激可以通过ERAD，负责识别和易位内质网中的末端错误折叠或未折叠的蛋白，将其靶向胞质蛋白酶体降解。已有文献报道Sel1L在哺乳动物ERAD和内质网稳态中具有不可或缺的作用[15,16]。我们的研究表明Sel1L缺失能降低BMDCs诱导分化过程中的增殖效率，并显著降低MHC-Ⅱ的表达。有研究显示ER跨膜E3泛素连接酶Hrd1通过促进BLIMP1泛素化和降解，进而增强MHC-Ⅱ表达[16]。BLIMP1是一种IFN-β基因的转录阻遏蛋白，是分化效应CD8+T细胞和CD8+T细胞记忆应答所必需的[17]，并且在经LPS刺激的BMDCs中显著表达，在DCs存活中起重要作用[18]，但Sel1L作为Hrd1的衔接蛋白是否是通过此途径调节MHC-Ⅱ的表达尚不清楚。同时我们数据显示Sel1L的缺失能上调MHC-Ⅰ的表达，有研究认为，内质网中错误折叠的MHC-Ⅰ能被Sel1L-Hrd1复合物识别并催化[19]，这与我们的结果相符。因此，Sel1L可能选择性调节MHC-Ⅱ的表达，并降解BMDCs中错误折叠的MHC-Ⅰ。

DC是专职抗原呈递细胞，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。在成熟过程中，DCs上调共刺激分子以及MHC-Ⅱ类分子，从而可以有效地将抗原呈递给初始T细胞。此外，成熟的DC产生和分泌促炎细胞因子和趋化因子来吸引和激活先天效应细胞，并诱导特定辅助性T细胞(Th)亚群的发育[20,21]。在DC抗原提呈的过程中，有大量蛋白质的合成与折叠，而错误折叠的多肽则保留在内质网中，并被ERAD机制识别和逆转录。哺乳动物具有许多ERAD复合物，其中Sel1L-Hrd1复合物是最具保守性和生物化学特征的。本实验表明当DC细胞缺失Sel1L基因时，其抗原递呈能力受到抑制，分泌因子的能力上调。IRE1α在多种细胞类型中作为Sel1L-Hrd1 ERAD复合物的内源性底物，其信号转导在肠道炎症以及肿瘤疾病中起到重要作用[22,23]，但Sel1L基因究竟是通过哪种分子机制影响DC细胞的免疫调节作用，还需后续实验研究。

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