miR-17-92启动子区多态性在广西人群中分布及与淋巴细胞关系①

王 荣 覃海媚 黄华佗 陆玉兰 郭 静 蓝 艳 王俊利 韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科，百色 533000)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的小分子非编码RNA，可通过和靶mRNA的3′非编码区结合后降低其稳定性或抑制翻译，从而调控基因表达[1]。免疫细胞的发育、增殖、分化等过程受到miRNA的调控。miR-17-92是影响淋巴细胞形成的关键基因簇，这些细胞是自身免疫性疾病、肿瘤及炎症反应等的重要基础[2，3]。启动子单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位点是疾病易感性探索的优先选择对象[4]。目前，尚未见miR-17-92启动子多态性与淋巴细胞间关系的研究。因此，我们检测次要等位基因(MAF)>10%的rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型，分析其多态性在不同人群中的差异和淋巴细胞数关系，为国内人群SNP分布资料及深入研究与免疫相关疾病关系提供基础数据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取来自我院的275例无亲缘关联的广西健康体检者，包括男性98例及女性177例，年龄17～78岁。所有对象的临床检查和实验室检测指标均正常。研究方案获得本院的伦理委员会审批，研究对象对研究内容知情同意并签署同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取 用EDTA-K2的血液采集管抽取受试者的肘正中静脉血3 ml。取其中的200 μl血液按天根(北京)公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，置于-20℃保存待用。

1.2.2引物合成 参考GenBank中的基因序列，本实验引物在Primer3.0在线软件(http://primer3.ut.ee/)进行，交由上海天昊生物科技有限公司合成。rs9515692C/T上游引物：5′-GGAAACAACCTGGAGGCTCTTCAA-3′，下游引物：5′-TTTCCTCTAACCTGAACCCCTGTCT-3′，延伸引物：5′-TTTTTTT-TTTTTTTCCAGTGATTTTCCTTATTACTGCTGA-3′；rs1-352743A/G上游引物:5′-TTGCTGACCGTAATCA-GCCACAT-3′，下游引物：5′-GGCAAACGACCACAGAGGAAAT-3′，延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTCCTCATTATTTTTAGTAAAAGG-GTTGA-3′。

1.2.3基因分型 PCR扩增体积共20 μl，有1.0 μl 样本DNA、2.0 μl缓冲液、2.0 μl dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μl，其余体积用双蒸水补足。PCR反应步骤：95℃ 2 min,94℃ 20 s、65℃ 40 s、72℃ 1.5 min，循环35次。72℃平衡 2 min。PCR产物经纯化进行延伸。纯化的延伸产物在ABI 3730XL测序仪检测，所得数据用GeneMapper 4.1作分析。DNA测序法进一步验证上述分型结果。

1.2.4淋巴细胞检测 抽取研究对象静脉血，取流式细胞仪专用试管加入已采集的抗凝血50 μl，采用对应的试剂盒在BD FACSCantoⅡ全自动流式细胞仪测试。

2 结果

2.1rs9515692C/T和rs1352743A/G基因分型 经检验2个SNP位点的基因型频率符合Hardy-Weinberg法则(P=0.194;P=0.409，P均>0.05)，说明人群有代表性。检测结果表明，rs9515692C/T存在3种基因型：CC(65.8%)、CT(29.1%)、TT(5.1%)；rs1352743A/G也存在3种基因型：AA(12.7%)、AG(49.1%)、GG(38.2%)。DNA测序结果与分型结果一致，见图1、2。

2.2广西人群中2位点的基因多态性分布 统计分析发现 rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型以及等位基因频率在男、女性之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3各位点多态性与其他人群间比较 广西人群rs9515692C/T和rs1352743A/G基因型及等位基因分布频率同欧洲、日本和非洲人群相比，显示差异均有统计学意义(P<0.05)。与北京人相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、3。

2.4各位点基因型与淋巴细胞的关系 统计分析基因型及模型的研究对象间年龄和性别的差异无统计学意义(P>0.05)。rs9515692C/T基因型间的B淋巴细胞数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B淋巴细胞数在CC/CT和TT比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。rs1352743A/G基因型间、显性模型和隐性模型的淋巴细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

图1 miR-17-92 基因簇rs9515962C/T位点测序图Fig.1 Sequencing map of genotype for miR-17-92 gene cluster rs9515692C/T polymorphismNote:The inverted triangles of panels ①-③ indicated CC，CT and TT genotypes,respectively.

图2 miR-17-92 基因簇rs1352743A/G位点测序图Fig.2 Sequencing map of genotype for miR-17-92 gene cluster rs1352743A/G polymorphismNote:The inverted triangles of panels ①-③ indicated AA，AG and GG genotypes,respectively.

表1广西人群中rs9515692C/T、rs1352743A/G基因型及等位基因频率的分布

Tab.1Distributionofgenotypeandallelefrequenciesofrs9515692C/Tandrs1352743A/GinGuangxipopulation

GendernGenotypefrequency(%)CC(AA)CT(AG)TT(GG)Allelefrequency(%)C(A)T(G)rs9515692C/TMale9863(643)30(306)5(51)156(796)40(204)Female177118(667)50(282)9(51)286(808)68(192)Total275181(658)80(291)14(51)442(804)108(196)rs1352743A/GMale9811(112)53(541)34(347)75(383)121(617)Female17724(136)82(463)71(401)130(367)224(633)Total27535(127)135(491)105(382)205(373)345(627)

Note：Genotype and allele frequencies of rs9515692C/T and rs1352743A/G showed no significant difference between male and female(P>0.05).

表2广西人群中rs9515692C/T基因型和等位基因分布频率与其他种族的比较

Tab.2Comparisonoffrequencyofrs9515692C/TpolymorphisminGuangxipopulationandotherethnicgroups

PopulationsnGenotypefrequency(%)CCCTTTAllelefrequency(%)CTGuangxipeople275181(658)80(291)14(51)442(804)108(196)HapMap⁃CEU1)22674(327)122(539)30(134)270(597)182(403)HapMap⁃HCB8654(628)28(326)4(46)136(791)36(209)HapMap⁃JPT1)17290(523)74(431)8(46)254(738)90(262)HapMap⁃YRI1)224162(723)60(268)2(09)384(857)60(143)

Note：1) Genotype and allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi people.

表3广西人群rs1352743A/G基因型和等位基因分布频率与其他种族的比较

Tab.3Comparisonoffrequencyofrs9515692C/TpolymorphisminGuangxipopulationandotherethnicgroups

PopulationsnGenotypefrequency(%)AAAGGGAllelefrequency(%)AGGuangxipeople27535(127)135(491)105(382)205(373)345(627)HapMap⁃CEU1)226104(460)104(460)18(80)312(690)140(310)HapMap⁃HCB8416(190)42(500)26(310)74(440)94(560)HapMap⁃JPT1)17254(314)92(535)26(151)200(581)144(419)HapMap⁃YRI1)226150(664)62(274)14(62)362(801)90(199)

Note：1) Genotype and allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi people.

表4miR-17-92基因rs9515692C/T基因型的淋巴细胞数比较

Tab.4Comparisonofnumberoflymphocytesingenotypesofrs9515692C/TinmiR-17-92

GenotypeThCTLBTh/CTLCC1)77731±2034753369±1662024788±7436153±042CT1)80533±1993151443±1749126686±7174171±053TT1)67700±1234744050±706717833±6281160±045Dominant77681±1909149800±1596124719±7826168±051Recessive1)79322±1987952276±1691125864±7249163±049

Note：1) The number of B lymphocytes showed significant difference in genotypes and recessive model,bothP<0.05.

表5miR-17-92基因rs1352743A/G基因型的淋巴细胞数比较

Tab.5Comparisonofnumberoflymphocytesingenotypesofrs1352743A/GinmiR-17-92

GenotypeThCTLBTh/CTLGG79118±1827154118±1767225014±6686156±046AG76375±1883751083±1595425808±8444163±052AA76000±2419043878±1040822667±8978178±048Dominant76214±2071947995±1402424462±8602170±050Recessive78150±1823453047±1690425294±7236159±048

Note：The number of lymphocytes showed no significant difference in genotypes,dominant model and recessive model,bothP>0.05.

3 讨论

启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，调控基因转录起始时间和表达的程度。启动子区SNPs可影响基因的转录，导致与之相关疾病的发生[5，6]。我们的结果表明，广西人群miR-17-92的rs9515692C/T和rs1352743A/G多态性与性别无关(P>0.05)。而同欧洲、日本以及非洲人比较差异有统计学意义(P<0.01)，和北京人比较差异无统计学意义(P>0.05)。这也符合基因多态性的“亲缘关系”。即广西人、北京人的亲缘关系，地理环境相对较近，基因多态性分布差异小；与欧洲人、日本人、非洲人的亲缘关系、地理环境较远，基因多态性分布差异大。此外，还可能和饮食习惯、生活环境和自然选择等因素有关[7]。提示在疾病的遗传学研究时应该结合地区和种族因素选择研究对象，不同人群的基因数据只宜作参照。

miR-17-92位于人类第13号染色体上(13q31-32)，其转录前体含有6个串联茎环发卡结构[8]。越来越多的研究证实miRNA的SNPs通过调节miRNA表达或可参与导致肿瘤的形成。研究表明，microRNA启动子区SNP可直接引起microRNA表达降低或增加[9，10]。Jia等[11]发现miR-146a中rs2910164位点CC基因型和C等位基因与中国人患非小细胞肺癌的风险性密切有关。然而，Hong等[12]发现rs2910164与韩国人的非小细胞肺癌患病风险无关。这些研究的研究对象来源不同，推测这种差异可能是导致疾病易感性结论不同的原因之一。至今，虽未见miR-17-92多态性和疾病易感性关系的报道。本研究开展对广西人群miR-17-92基因簇rs9515692C/T和rs1352743A/G多态性研究，并和不同人群进行比较。这正好为miR-17-92多态性群体遗传学普查提供了资料，也对今后探索多态性和疾病的关系起到指导作用。本研究发现rs9515692C/T多态性和B淋巴细胞数相关。因此，在以后探讨和免疫相关疾病的关系时，建议可优先选取rs9515692C/T位点。

本研究实施广西人群的miR-17-92基因簇启动子的单核苷酸多态性研究，比较不同人群的分布情况，发现rs9515692C/T和rs1352743A/G多态性在不同人群间存在差异。此外，rs9515692C/T多态性还与B淋巴细胞数存在相关性。因此，进一步研究miR-17-92多态性和免疫相关性疾病的关系是未来的新方向。但是，本研究样本量较小，结果仅具有区域代表性，仍需大样本和多地区实施研究。

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