蓉黄颗粒对非透析肾虚湿热证慢性肾脏病矿物质和骨异常患者血清OPG、RANKL水平的影响①

胡顺金 曹媛茹 王 东 李晓锋 王余婷 金 华 茅燕萍 任克军 章雪莲 王亿平 王拥军

(安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031)

慢性肾脏病矿物质和骨异常(Chronic kidney disease mineral and bone metabolism disorder，CKD-MBD)是慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)的常见并发症之一，其发病率高、危害性大，严重影响CKD患者的生活质量。早期给予CKD患者合理的治疗，可提高CKD患者的生活质量，降低其死亡率。目前，西医对CKD-MBD的治疗为基础治疗及活性维生素D、钙剂等药物的应用，而对其他防治CKD-MBD的药物疗效尚存争议。中医药对此具有明显的优势，尤其是在辨证论治的原则指导下，可显著改善患者临床症状，提高临床疗效。前期研究发现，蓉黄益肾解毒汤具有改善早中期CKD肾虚湿热证患者临床症状，延缓肾衰竭进展的作用[1]。本研究旨在观察蓉黄颗粒对非透析CKD-MBD患者血清骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)水平的影响，探讨其作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1CKD的诊断和分期标准[2]CKD诊断标准：①肾损害(包括肾脏结构或功能异常)≥3个月，伴或不伴肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GFR)的下降。可出现下列表现之一：肾脏病理学检查异常；或肾损害的指标阳性：血、尿成分异常或影像学检查异常；②GFR<60 ml/(min·1.73 m2)≥3个月，有或无肾脏损害的依据。CKD分期标准：1期：GFR≥90 ml/min；2期：GFR 60～89 ml/min；3期：GFR 30～59 ml/min；4期：GFR 15～29 ml/min；5期GFR<15 ml/min，或进入透析替代治疗。

1.1.2CKD-MBD诊断标准 参照2013年中华医学会肾脏病学分会颁布的《慢性肾脏病矿物质和骨异常诊治指导》拟定[3]：①钙(Ca)、磷(P)、全段甲状旁腺激素(intactparathyroidhormone，iPTH)或维生素D代谢异常；②骨转化、矿化、骨量、骨线性生长或强度异常；③血管或其他软组织钙化。具备其中一项或多项即可诊断CKD-MBD。

1.1.3中医辨证标准 肾虚湿热证参照《中药新药治疗慢性肾功能衰竭临床研究指导原则》中肾虚证、湿热证证候标准拟定[4]：主症：腰酸膝软，肢体困重，口中黏腻，食少纳呆，口干，口苦；次症：乏力，脘腹胀满，恶心，呕吐。舌象及脉象：舌红苔黄腻，脉濡数。诊断条件：主症必备，次症或兼，结合舌象脉象。根据中医症状量化评分标准[4]，各症状按轻、中、重程度分别记3、6、9分。

1.1.4纳入标准 ①符合西医诊断标准和中医辨证标准的非透析CKD 3～5期的CKD-MBD患者；②CKD 3期患者iPTH>70 pg/ml，CKD 4期患者iPTH>110 pg/ml，CKD 5期患者iPTH>300 pg/ml；③高血压、电解质紊乱、酸中毒等均得到有效控制；④未接受血液或腹膜透析、肾移植等替代治疗，近半年内未使用糖皮质激素等药物；⑤排除自身免疫性疾病、肝功能损害、恶性肿瘤等疾病；⑥年龄18～55岁；⑦知情同意者。

1.1.5排除标准 ①不符合纳入标准者；②行甲状旁腺全切或次全切除术者；并发有严重心、脑血管疾病或造血系统疾病等患者；③原发性甲状旁腺功能亢进症、继发性甲状旁腺增生、已绝经女性、迟发性营养性佝偻病及其他原因引起的代谢性骨病者；④精神性疾病等无法合作者；⑤患者依从性差、不能遵医嘱服药而影响疗效判定者；⑥患者资料不全，无法判定其疗效者。

1.1.6脱落及中止试验标准 ①依从性差，不能坚持参加研究者；②临床研究过程中出现特殊生理变化、严重并发症或不良反应，不宜继续本研究者；③病情进展较快，中途进入透析或肾移植等替代治疗者；④自然脱落或失访，包括试验中主动要求退出或未完成疗程而影响疗效或安全性判断的受试者均视为脱落。

1.1.7一般资料 将安徽省中医院肾病科2015年7月～2016年1月符合纳入标准CKD-MBD患者70例，按入组顺序编为1～70号，根据随机数字表法[5]随机分为治疗组和对照组各35例，治疗过程中脱落9例(其中治疗组5例，对照组4例)，最终实际完成61例：治疗组30例，对照组31例。治疗组，男17例，女13例；年龄32～53岁，平均(44.70±5.55)岁；基础疾病：慢性肾小球肾炎16例，高血压肾损害12例，多囊肾2例；CKD分期：3期5例，4期19例，5期6例；发现肾功能损害病程：5～43个月，平均(28.32±6.26)个月。对照组，男21例，女10例；年龄27～51岁，平均(42.10±6.87)岁；基础疾病：慢性肾小球肾炎19例，高血压肾损害10例，多囊肾2例；CKD分期：3期6例，4期21例，5期4例；发现肾功能损害病程：3～51个月，平均(26.74±6.65)个月。两组患者性别、年龄、基础疾病、CKD分期、病程等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另选取我院同期健康体检者20名设为正常组，其中男10例，女10例，年龄30～50岁，平均(42.55±4.92)岁，检测其血清OPG、RANKL水平。

1.2方法

1.2.1治疗方法 两组患者均予控制原发病、合理饮食、降压、纠正贫血、纠正钙磷代谢紊乱、抑制甲状旁腺功能亢进(骨化三醇的用法、用量，根据专家共识确定[6]，并取其中间剂量)等对症处理，并注意用药和剂量的均衡性，避免使用可能导致肾功能损害加重的药物；两组患者均予院内制剂黄苓解毒泄浊颗粒保留灌肠以清热解毒、化瘀泄浊。治疗组在对照组基础治疗上加用蓉黄颗粒(即蓉黄益肾解毒颗粒，在蓉黄益肾解毒汤基础上制成的院内制剂，由肉苁蓉10 g、生大黄10 g、六月雪10 g、茯苓10 g、牛膝10 g、桃仁6 g、蒲公英15 g、姜竹茹8 g、甘草6 g组成，生产批号：20150313)口服，每袋10 g，每次1袋，每日3次，温开水冲服。两组疗程均为8周。

1.2.2观察指标 观察两组患者临床表现，治疗前后血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(Serum creatinine,Scr)水平，并采用EPI公式[7]计算出肾小球滤过率估算值(estimated glomerular filtration rate，eGFR)；血Ca、P、iPTH、碱性磷酸酶(Alkalinephos-phatase，ALP)水平；治疗前后OPG、RANKL水平，并计算出OPG/RANKL比值，治疗前与正常组比较。采用双抗体夹心酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清OPG、RANKL水平，主要试剂OPG和RANKL均来源于上海森雄科技实业有限公司(批号分别为Y130987和Y131669)。

1.2.3CKD-MBD疗效判定标准 参照2013年中华医学会肾脏病学分会颁布的《慢性肾脏病矿物质和骨异常诊治指导》[3]、王海燕主编《肾脏病学》第3版[8]和《中药新药临床研究指导原则(试行)》中“中药新药治疗慢性肾功能衰竭临床研究指导原则”[4]拟定：①显效：临床症状积分减少≥60%；血清Ca、P、iPTH至少两项在目标范围内。②有效：临床症状积分减少≥30%；血清Ca、P、iPTH有一项在目标范围内[8]。③无效：临床症状积分减少<30%；血清Ca、P、iPTH均不在目标范围[8]。

2 结果

2.1疗效分析 两组患者临床疗效经χ2检验，治疗组显著优于对照组，差异具有显著统计学意义(χ2=7.283，P=0.007)。见表1。

2.2对中医证候积分值的影响 两组患者治疗前中医证候积分值比较无明显差异(P>0.05)；治疗4周末、8周末证候积分值均较治疗前下降(P<0.01)，且治疗8周末积分值较治疗4周末亦显著降低(P<0.01)；治疗4周末、8周末治疗组积分值下降程度均明显优于对照组(P<0.01)。见表2。

表1两组患者临床疗效比较[n(%)]

Tab.1Comparisonofclinicaleffectbetweentwogroups[n(%)]

GroupsnMarkedlyEffectiveStableTotalefficiencyControlgroup311(323)10(3226)20(6451)11(3549)Treatmentgroup309(3000)12(4000)9(3000)21(7000)1)

Note：Compared with control group，1)P<0.01.

2.3对肾功能的影响 两组患者治疗前BUN、Scr、eGFR均无明显差异(P>0.05)。治疗组在治疗4周末、8周末，BUN、Scr水平均下降，eGFR均升高，而治疗8周末BUN、Scr、eGFR与治疗前相比，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。对照组在治疗8周末仅BUN水平较治疗前下降显著(P<0.05)。治疗8周末，治疗组BUN、Scr、eGFR改善均显著优于对照组(P<0.05)。见表3。

2.4对血清Ca、P、iPTH及ALP的影响 两组治疗前血清Ca、P、iPTH及ALP水平比较均无显著差异(P>0.05)。治疗组治疗4周末及8周末，上述指标均得到不同程度的改善，而治疗8周末改善更明显，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；对照组治疗8周末仅iPTH较治疗前下降显著(P<0.01)；治疗8周末，治疗组血清Ca、P、iPTH及ALP的改善显著优于对照组(P<0.05)。见表4。

2.5对血清OPG、RANKL的影响 治疗组和对照组治疗前血清OPG、RANKL水平比较均无明显差异(P>0.05)；均较正常组显著升高(P<0.01)，OPG/RANKL比值较正常组降低(P<0.01)。治疗前，治疗组和对照组血清OPG、RANKL水平及OPG/RANKL比值差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，治疗组患者血清OPG、RANKL水平及OPG/RANKL比值均较治疗前显著改善(P<0.01或P<0.05)；而对照组治疗后仅OPG/RANKL比值较治疗前升高(P<0.01)；治疗组治疗后血清OPG、RANKL水平及OPG/RANKL比值均较对照组改善显著(P<0.05或P<0.01)。见表5。

GroupsnBeforeintegralAfter4weeksIntegralDeclinedegreeAfter8weeksIntegralDeclinedegreeControlgroup315381±8834568±11481)813±8773494±10381)2)1887±884Treatmentgroup305530±6853700±11121)3)1830±9633)2250±9641)2)3) 3280±10123)

Note：Compared with the same group before treatment，1)P<0.01；compared with the same group after 4 weeks，2)P<0.01；compared with the same period in the control group，3)P<0.01.

GroupsnTreatmentphaseBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)eGFR(ml/min)Controlgroup31Beforetreatment1598±59329733±81582194±882After4weeks1481±55930304±79792114±794After8weeks1237±4981)30400±86622138±873Treatmentgroup30Beforetreatment1615±49430646±104232124±1025After4weeks1352±4211)28876±100792301±1144After8weeks998±2882)3)4) 25274±97951)4) 2829±16171)4)

Note：Compared with the same group before treatment,1)P<0.05，2)P<0.01；compared with the same group after 4 weeks，3)P<0.05；compared with the same period in the control group，4)P<0.05.

GroupsnTreatmentphaseCa(mmol/L)P(mmol/L)iPTH(pg/ml)ALP(U/L)Controlgroup31Beforetreatment198±022172±04430308±1593811474±3733After4weeks200±025169±04225896±1306011413±3558After8weeks202±022166±038 19945±102762)11368±3211Treatmentgroup30Beforetreatment191±027170±04530755±1645011980±3790After4weeks199±025165±04124074±1265411247±3586After8weeks220±0192)4)5)146±0271)4)5) 14700±79932)4)5)9630±32221)5)

Note：Compared with the same group before treatment,1)P<0.05，2)P<0.01；compared with the same group after 4 weeks,3)P<0.05，4)P<0.01；compared with the same period in the control group,5)P<0.05.

GroupsnTreatmentphaseOPG(pg/ml)RANKL(pg/ml)OPG/RANKLNormalgroup20-18921±414510824±3503187±042Controlgroup31Beforetreatment39001±71901)26009±35051)149±0121)Aftertreatment40165±665624824±3519162±0113)Treatmentgroup30Beforetreatment37976±71211)24828±35351)153±0211)Aftertreatment43869±70403)4)22949±35372)4)192±0253)5)

Note：Compared with the normal group，1)P<0.01；compared with the same group before treatment,2)P<0.05，3)P<0.01；compared with the same period in the control group,4)P<0.05，5)P<0.01.

3 讨论

古代中医文献没有针对CKD-MBD的病名，但“肾主骨”理论很早就已提出，将其归于“骨痿”、“骨痹”等范畴。中医认为肾为先天之本，主一身气化，肾之病变，则气化失司，浊邪蓄留体内，正虚导致血瘀、湿浊内蕴、郁久化热，同时瘀血、湿热进一步损伤正气，致病情逐渐恶化。由此可见，本病病位在肾，肾气衰败、湿热内停、瘀血浊毒蕴结是其基本病机。因此，治则上应标本兼顾，故确立益肾清热泄浊，兼以化瘀的基本治法。蓉黄颗粒正是基于此理论，在临床应用多年的蓉黄益肾解毒汤基础上加工而成的院内制剂。方中肉苁蓉补肾益精、润肠通便，生大黄清热解毒、通腑泄浊，共为君药。牛膝补肾强筋、活血祛瘀，蒲公英清热解毒、利湿通淋，共为臣药。六月雪清热利湿，姜竹茹清热除烦，茯苓淡渗利湿，桃仁活血化瘀，共为佐药。甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共凑益肾、清热、泄浊、兼以祛瘀之效。研究发现大黄的主要成分大黄酸能减少单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)肾皮质脂质过氧化物的产生[9]，同时增加抗氧化酶的含量，通过下调转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的表达，从而减轻肾间质纤维化，发挥肾保护作用。肉苁蓉的主要成分肉苁蓉总苷可明显降低缺血再灌注肾损伤大鼠的BUN、Scr水平，增加损伤肾组织中凋亡抑制蛋白，阻断细胞凋亡的发生，对损伤肾脏起到了保护作用[10]。李均等[11]采用UUO大鼠模型，发现桃仁可通过抑制结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)的过度表达，而减缓肾间质纤维化病程进展。

本研究结果显示：治疗组临床疗效显著优于对照组(P<0.01)；中医证候积分值随疗程的增加，下降愈显著(P<0.01)，且治疗组下降幅度显著优于对照组(P<0.01)；亦可改善患者的肾功能及有效纠正钙磷代谢紊乱，且均显著优于对照组(P<0.05或P<0.01)。

OPG、RANK、RANKL都是肿瘤坏死因子超家族成员。OPG/RANK/RANKL系统与骨代谢有着密切关系，是钙磷代谢紊乱及骨异常的核心调节系统[12]。RANKL由成骨细胞及间质细胞合成，可促进破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞，通过RANK/RANKL系统与各自的受体相互作用，导致破骨细胞的生成和生存时间延长，增强骨吸收[13]。OPG竞争性抑制RANKL与RANK结合，抑制破骨细胞增殖、分化，降低破骨细胞活性，诱导其凋亡，进而抑制骨吸收。Mohamed等[14]研究发现，CKD患者血清OPG、RANKL水平均较普通人群升高，OPG/RANKL比例失调是引起骨代谢紊乱的主要因素。许多研究发现CKD患者血清OPG的水平明显比正常对照组高，但在骨骼局部表达减少，而机制尚不明确[15]，可能是CKD时代偿性增高的PTH通过促进成骨细胞产生RANKL抑制可溶性OPG的产生，减轻OPG对破骨细胞分化的抑制而促进骨吸收。Padagas等[16]在对5/6肾切除大鼠模型的实验研究中，给予实验组大鼠OPG-Fc融合蛋白处理，结果显示实验组大鼠较模型组能明显降低甲状旁腺功能亢进引起的高度骨转换、骨破坏，提示RANKL抑制剂(OPG-Fc融合蛋白)可以阻断甲状旁腺功能亢进引起的骨破坏，提示RANKL可能作为CKD患者骨保护的关键治疗靶点。OPG、RANKL与CKD患者的动脉硬化亦有关。研究显示，在动脉硬化部位RANK、RANKL表达上调，RANKL/OPG的比值增加[17-19]。本研究结果显示：非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者血清OPG、RANKL水平明显高于正常人群，表明CKD-MBD患者存在OPG/RANKL系统的紊乱。经治疗后，治疗组可升高血清OPG含量、降低血清RANKL水平及提高OPG/RANKL比值，且均明显优于对照组(P<0.05或P<0.01)。综上所述，蓉黄颗粒可以改善非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者临床症状，纠正钙磷代谢紊乱，保护肾功能，从而有效防治CKD-MBD，其作用机制可能与提高血清OPG含量、降低血清RANKL水平及升高OPG/RANKL比值密切相关。

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