一种新型HIV-1 DNA检测试剂的临床应用评价

李龙 杜聪 赵芳凝 徐斌 郑敏娜 李宗娜 周宁 龚卉 郭燕 程绍辉 于茂河

300011天津市疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制室(李龙、赵芳凝、郑敏娜、周宁、龚卉、郭燕、程绍辉、于茂河)；300400天津精耐特基因生物技术有限公司(杜聪、徐斌、李宗娜)

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的致病因子[1]。HIV是一种双链RNA逆转录病毒,进入人体后选择性入侵人体免疫系统的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞,在细胞内经逆转录合成cDNA,并整合进入宿主细胞的基因组DNA中,形成前病毒。随后以前病毒为模板,利用宿主细胞内的RNA转录、剪切、蛋白翻译、包装等机制生产更多的HIV病毒颗粒并释出细胞外。如此周而复始,感染更多的CD4+T淋巴细胞[2]。HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作要解决的首要问题。要确认是否感染HIV病毒,可以通过检测HIV的病毒核酸、抗体、抗原、或病毒分离培养等方法。而DNA检测在艾滋病早期诊断以及抗病毒治疗后患者的HIV-1潜伏细胞群即病毒储藏库内前病毒的监测中具有重要意义[3-4]。目前国内外尚未见单独检测HIV DNA的同类试剂上市,各实验室采用的方法多为内部科研方法,方法的标准化程度不够,缺乏可比性。本研究是对一种新型HIV-1 DNA检测试剂的临床应用性能指标进行评价,为后续的临床应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源2017年4～11月,天津市疾病预防控制中心艾滋病确证中心实验室依照《全国艾滋病检测技术规范》2015版[5]进行检测判断的结果为HIV抗体阳性样品59例,阴性样品36例,HIV抗原抗体诊断试剂检测阳性且对比试剂1(Western blot,WB确证试剂)检测结果不确定的样本17例,弱阳性标本1例,特异性标本8例。所有样本均为全血样本,进行盲法编号后-30℃冻存。标本采集获得患者或家属知情同意。

I/II型人类嗜T细胞病毒(HTLV-I/II)、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A)、EB病毒(EBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、系统性红斑狼疮(SLE)、抗核抗体(ANA)、类风湿因子(RF)特异性样本各1份,由天津医科大学总医院提供,本实验室用特异诊断试剂进行复核。

1.2 主要试剂人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA检测试剂盒(PAP核酸扩增实时荧光PCR法)为天津精耐特基因生物技术有限公司研制(批号：09H13Q)；对比试剂1：人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗体蛋白印迹试剂盒,MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd.(批号：AE6028)；对比试剂 2：人类免疫缺陷病毒1型核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光法)雅培贸易(上海)有限公司(批号：478846)；人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒,北京万泰生物药业股份有限公司(批号：H20161010)

1.3 实验操作及结果判定

1.3.1 感染状态判定：依照《全国艾滋病检测技术规范》2015版进行检测,使用确证试剂(对比试剂1)判断样品的感染状态,对于确证结果为不确定的样本,进行随访检测,随访检测仍为不确定的以核酸结果判断感染状态。特异性样本采用经国家药监局批准注册有证产品进行检测复核。

1.3.2 HIV-1 DNA检测：盲法编号的样本解冻吸取200μl全血进行基因组DNA提取,操作按照说明书(QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit)进行,注意需要延长蛋白酶K的消化时间至2～4 h,以彻底清除各种蛋白质类抑制物。将已提取好的DNA样本、阳性对照、阴性对照分别加入1组检测孔(2孔/组)中,每孔分别加入17μl。加样结束后盖紧盖子并震荡混匀,离心去除气泡。按照说明书设定扩增反应程序(96 ℃ 2 min,1个循环；96 ℃ 12 s、60 ℃ 30 s、64℃ 30 s、68℃ 30 s,40个循环),将八联管置于荧光PCR仪(BioRad CFX96)中,待反应结束后读取各样本的Ct值,Ct≤39判定为阳性,Ct＞39判定为阴性。实验结果解盲后进行数据统计分析。

1.4 统计学方法主要分析指标：以HIV感染状态(样品的HIV-1感染状态结果)为相对标准,分析考核试剂的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%的置信区间,并用SPSS统计软件对考核试剂和HIV-1感染状态结果进行Kappa检验。次要分析指标：以HIV感染状态(样品的HIV-1感染状态结果)为相对标准,分析考核试剂和对比试剂2的阳性检出例数,阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%的置信区间,并用SPSS统计软件对考核试剂和对比试剂2检测结果进行Kappa检验。

2 结果

2.1 HIV-1DNA试剂检测结果与HIV-1感染状态结果比较本次实验共入选97例,最终取得有效结果并纳入统计95例(有两例样本经随访检测结果为不确定且核酸检测失败)。结果见表1,考核试剂阳性符合率为100%(59/59),95%CI：93.94% ～100%；阴性符合率为 100%(36/36),95%CI：90.26% ～100%；总符合率为100%(95/95),95%CI：96.19% ～100%；Kappa值为 1,95%CI：1.00 ～1.00,表明考核试剂检测结果与抗体检测结果(HIV-1感染状态结果)一致。

表1 HIV-1DNA试剂检测结果与样品的HIV-1感染状态结果比较(n)Tab.1 Comparison of HIV-1 DNA test results and HIV-1 infection status of samples(n)

2.2 HIV-1DNA试剂检测结果与RNA定量检测试剂检测结果比较对比检测试剂2与考核试剂在检测结果上出现差异,结果见表2,考核试剂阳性符合率为100%(41/41),95%CI：(91.40% ～100%)；阴性符合率为76.74%(33/43),95%CI：(61.37%～88.24%)；总符合率为 88.10%(74/84),95%CI：(79.19% ～94.14%),Kappa值为0.736,95%CI：(0.629～0.897)。

表2 HIV-1DNA试剂检测结果与对比试剂2检测结果比较(n)Tab.2 Comparison of the results of HIV-1DNA reagent and reference reagent 2(n)

2.3 弱阳性,不确定,特异性样本结果分析

2.3.1 HIV-1DNA试剂对于弱阳性标本检测的准确性验证：HIV-1抗体弱阳性样本(复检抗体检测OD0.229)共入选1例,结果见表3,按照规范进了补充试验,对比试剂1(WB检测试剂)结果为不确定,随访检测仍为不确定。首次检验样本对比试剂2(RNA定量)检测结果为：37 544拷贝/ml。对于弱阳性样本考核试剂检测结果为阳性,与对比试剂2检测结果一致。

2.3.2 考核试剂对于HIV抗原抗体检测阳性且对比试剂1(WB确证试剂)检测结果阴性的检测：共入选10例,最终取得有效结果并纳入统计10例,考核试剂检测结果均为阴性,对比试剂2(RNA检测试剂)结果均为阴性,对比试剂1(WB确证试剂)结果均为阴性,三者结果一致。

2.3.3 HIV抗原抗体检测阳性且对比试剂1(WB确证试剂)检测结果不确定的样本：共入选17例,最终取得有效结果并纳入统计15例(有两例样本经随访检测结果为不确定且RNA检测失败)。这15例不确定标本通过随访检测结果为阳性,或对比试剂2(RNA检测试剂)检测结果数值＞5 000拷贝/ml。考核试剂检测结果均为阳性,考核试剂检出率100%。

2.3.4 特异性样本检测验证：共入选8例,最终取得有效结果并纳入统计8例,使用考核试剂及对比试剂1(WB确证试剂)、对比试剂2(RNA检测试剂)进行检测,评价考核试剂的特异性；考核试剂及对比试剂1结果为阴性,对比试剂2检测结果有一例检测失败其余为未检出(表4)。

3 讨论

本试剂盒采用以焦磷酸化激活的聚合反应(pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)[6]为基础的核酸扩增技术来扩增HIV-1前病毒的高度保守区域,同时采用荧光标记的引物发出实时荧光信号,从而实现对HIV-1 DNA和内源性人类基因组DNA总量的检测。该试剂为定性试剂,其特殊的PAP法通过使用特异阻断性引物,把焦磷酸化反应和聚合反应串联耦合而达到最佳效果,具有超高的灵敏度和选择性,使用血样标本即可检测宿主细胞中被整合的HIV病毒基因,可以从掺杂的10亿个几乎完全相同的核酸分子(包括DNA和RNA)中直接特异性地扩增出1个拷贝的靶基因。

表3 1份弱阳性样本检测验证Tab.3 Verification for one weakly positive sample

表4 8份特异性样本验证Tab.4 Verification for eight specific samples

该试剂在对于感染早期的不确定标本检测中显示出一定的优势,在15例不确定标本中检测结果为阳性,而这15例标本通过随访检测确证结果为阳性,或对比试剂2(RNA检测试剂)检测结果数值＞5 000拷贝/ml。考核试剂检出率100%。另外该试剂在假阳性、特异性标本检测中显示出良好的特异性。在10例HIV抗原抗体检测阳性且对比试剂1(WB确证试剂)检测结果阴性,证实该试剂可有效排除四代试剂产生的假阳性结果。在8例特异性标本的检测中,考核试剂及对比试剂1结果一致,无假阳性结果出现。

对比检测试剂2与考核试剂在检测结果上出现差异,考核试剂阳性符合率为100%,阴性符合率为76.74%,总符合率为 88.10%,所得Kappa值为0.736。调查样本的流行病学资料,分析其原因为纳入统计的样本患者已经接受了抗病毒治疗,经过抗病毒治疗后血浆中HIV-1 RNA降至低于检测下限[7],而感染者的血液、精液或淋巴结中仍有大量HIV-1前病毒DNA存在,构成病毒储藏库[8-9]。所以出现了部分样品考核试剂检测结果为阳性而对比试剂2结果为阴性。对比检测试剂2出现了多例检测失败,原因可能为HIV-1 RNA对样本质量要求较高,容易受到样本中血红蛋白、三酰甘油的影响,对于发生严重溶血的样本无法完成检测。文献报道当血红蛋白浓度为97 g/L时HIV RNA和试剂内标质控均未被检出[10],而DNA检测试剂对样本质量兼容性更高,成功完成了检测。

本研究表明,考核试剂检测结果与HIV-1感染状态一致,可以认为与现在我国所采用的HIV-1检测试剂等效,且能有效鉴别出感染早期的不确定标本。与进口RNA定量检测试剂盒相比,能有效的检测出接受抗病毒治疗患者的病毒储藏库中HIV-1 DNA,具有良好的临床应用价值。

利益冲突无