17例病毒性肺炎老年患者的临床特点及甲型H1N1流感病毒分子特征

葛以跃 谭焰 陈晨 吴涛 朱小娟 赵康辰 王丽 谷伟 崔仑标

210009南京,卫生部肠道病原微生物重点实验室江苏省疾病预防控制中心(葛以跃、吴涛、朱小娟、赵康辰、崔仑标)；210006南京医科大学附属南京医院呼吸科(谭焰、陈晨、王丽、谷伟)

流感病毒分为甲、乙、丙3种类型,其中甲型流感病毒的宿主最为广泛,其抗原变异率也最高,容易引起大流行。2009年初,一种新型甲型H1N1流感病毒(pandemic H1N1/09 virus)首先在墨西哥发现,而后在全球不断蔓延[1],目前已成为季节性流感病毒的一部分,严重威胁着人类健康[2]。

老年人的各个器官生理功能逐步下降,如同时伴有慢性基础性疾病,则更容易感染流感病毒,而且很容易发展为肺炎.研究表明,肺炎是流感患者病情加重和死亡的重要原因[3]。国家流感中心流感监测结果显示,自2017年底至2018年初,我国流感发病率较往年同期明显升高,以甲型H1N1流感和乙型流感的流行为主,伴随着部分甲型H3N2流感的流行。与往年相比,乙型流感病毒的Yamagata型显著增多,使得现有三价疫苗对该病毒亚型失去预防作用。对于此次流行的甲型H1N1流感病毒,尚未见病原学特征显著改变的相关报道,进一步研究其病原分子特征对于疾病的预防和诊治具有重要意义。本研究对南京市第一医院呼吸科2018年1～3月份收治的,确诊为甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者的临床资料和流感病毒病原学进行分析,探讨老年人甲型H1N1流感病毒性肺炎的临床特点及本流行季的病毒分子特征,为老年流感的防治提供依据,提高临床诊治效果。

1 材料与方法

1.1 研究对象在2018年1～3月份期间,收集在南京市第一医院呼吸科住院的有流感样症状的老年(≥60岁)肺炎患者40例,最终确诊为甲型H1N1流感病毒感染者共17例。入选标准：(1)出现过流感样症状；(2)病程中经胸部CT或胸片检查证实肺炎存在；(3)患者痰标本或鼻咽拭子标本甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性。病例的临床资料采用统一标准的数据采集表进行收集。本研究获得南京第一医院伦理委员会审查通过,标本采集获得患者或家属知情同意。

1.2 仪器与试剂全自动核酸提取仪及其配套试剂(EX-DNA/RNA病毒)购自西安天隆科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(7900HT)购自美国Life Technologies公司；PrimeScrip RT reagent Kit(Perfect Real Time)、PrimeScript Reverse Transcriptase和 LA Taq购自日本 TaKaRa公司；Nextera XT Library Preparation Kit和MiSeq Reagent Kit v3(600 cycles)购自美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与病毒核酸检测：采集目标患者的痰标本或鼻咽拭子标本,-80℃冰箱保存。参照全自动核酸提取仪和病毒核酸提取试剂盒使用说明书提取病毒总核酸。采用One Step PrimeScrip RTPCR Kit通过Real-time RT-PCR法[4-5]检测甲型流感病毒及其亚型(季节性H3N2和甲型H1N1流感病毒)。同时采用Real-time PCR/RT-PCR法对每一份样本的28种常见呼吸道病原进行检测,观察是否存在合并感染。

1.3.2 病毒全基因组扩增和高通量测序：采用Primescript Reverse Transcriptase和甲型流感病毒8节段通用逆转录引物进行反转录反应,制备的cDNA进一步采用LA Taq和一对甲型流感病毒通用引物扩增流感病毒全基因组,纯化并回收PCR产物。采用Qubit 2.0荧光剂对PCR产物进行定量,而后作为模板制备测序文库,具体操作按Nextera XT Library Preparation Kit说明书进行。将制备好的文库加入MiSeq测序样品孔,按2×300 bp进行末端配对测序。

1.4 测序数据分析测序产生的fastq原始数据采用生物信息学综合分析工具CLC Genomic Workbench 7.5.1进行处理和分析。从全球流感共享数据库(GISAID)下载甲型H1N1流感病毒参考序列,采用MEGA 6.0软件对病毒进化进行分析,通过邻接法(Neighbor-joining)构建系统发生树,重复抽样1 000次(Bootstrap=1 000)对进化树进行验证。同时通过对氨基酸序列比对进一步分析病毒的抗原位点、毒力位点和耐药位点的变异情况。

1.5 统计学方法计量资料采用±s表示,计数资料采用构成比来表示,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率法,检验水准为0.05。

2 结果

2.1 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的一般资料在有流感样症状的40例老年(≥60岁)肺炎患者中,通过病毒核酸检测,最终确诊为甲型H1N1流感病毒感染的共有17例。如表1所示：在17例甲型H1N1流感患者中,7例存在合并感染,比例达41.2%,其中合并单纯疱疹病毒感染2例,合并鼻病毒、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和EB病毒感染的各1例。患者平均年龄为73.8±10.8岁,9例≥75岁(52.9%),其中男性占总例数的57.9%。重症与危重症病例的比例为0.89∶1。所有患者至少合并1种基础性疾病,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、高血压和脑血管病是最为常见的基础病,合并比例分别为52.9%、52.9%和35.3%。存在1种以上基础病的患者比例达70.1%,存在重要基础性疾病(冠心病、充血性心力衰竭、慢性肾功能不全、恶性肿瘤、肝硬化和免疫抑制)的比例为41.2%。在本组老年人群中,流感疫苗的接种率为0%。

表1 患者一般资料和基础性疾病合并情况Tab.1 General information and the existence of underlying diseases of the patients

2.2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的临床特征和实验室检查在甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者中,呼吸系统症状和发热是最为主要的临床表现。88.2%的患者存在发热,最高体温为38.38±0.84℃,其中高热(≥39℃)患者所占比例为41.2%。咳嗽、咽痛、呼吸困难的比例分别为100%、11.8%和76.5%。23.5%的患者同时伴有消化道症状。患者的白细胞计数为(6.25±2.77)×109/L,以正常和降低为主。47.1%的患者伴有低钠血症,其中2例(11.8%)属于重度(＜125 mmol/L)。部分患者伴有肝功能异常,谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素异常的比例分别为11.8%、17.6%和11.8%。94.1%的患者均伴有乳酸脱氢酶的增高。胸部影像表现为双肺病变的比例为76.5%,其中危重症患者双肺病变的比例高于重症患者,但差异无统计学意义(P＞0.05)。详细结果见表2。

2.3 氨基酸位点分析

2.3.1 抗原位点和宿主特异性位点：与疫苗株相比,所测毒株HA蛋白10处氨基酸变异中有9处发生在HA1上,其中3处发生在抗原位点上(Ca、Cb和Sa各1个),分别为H138Y、S74R和S164T,具体变异情况见表3。受体结合位点(Receptor-binding site,RBS)是流感病毒宿主特异性的一个重要决定因素,本研究所有毒株的HA蛋白未发生RBS的氨基酸变异。除了RBS外,PB2中的一些位点在宿主特异性中也发挥重要作用,通过比较发现,所测毒株PB2蛋白的宿主特异性位点均与疫苗株相同,为590S、591R、627E、701D 和714S。

2.3.2 潜在糖基化位点：疫苗株A/Michigan/45/2015的HA蛋白有9个潜在糖基化位点(10NNST、11NST、23NVT、87NGT、162NQS、276NTT、287NTS、481NGT和540NGS),除了A/Nanjing/2018031/2018的潜在糖基化位点与疫苗株完全相同外,其余8株病毒HA蛋白的162位均为162NQT,但同样为N-糖基化位点的保守序列模式,所以未发生潜在糖基化位点数量上的增减。

2.3.3 毒力位点和耐药位点：与疫苗株相同,所有毒株的HA裂解位点均为为PSIQSR↓GLFGA,只含有一个碱性氨基酸,为非高致病力特征。除了HA裂解位点外,流感病毒的毒力位点分布于多个节段上。通过分析发现,所测毒株的相关毒力位点特征为：222D(HA,H1 numbering)、139T(M1)、215 A(M1)、42S(NS1)、92D(NS1)、36 A(PA)、353 K(PA)、99H(PB1)、368I(PB1)、89 V(PB2)和 357H(PB2),与疫苗株保持一致,未发生毒力改变。在耐药方面,A/Nanjing/2018029/2018毒株的NA发生了H275Y(N1 numbering)变异,提示可能对流感病毒神经氨酸酶抑制剂类药物耐药。

表2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的临床症状和实验室检查Tab.2 Clinical features and laboratory examination of the influenza A(H1N1)viral pneumonia in the elderly

表3 甲型H1N1病毒HA蛋白氨基酸位点变异情况Tab.3 Variation of HA amino acid sites of the influenza A(H1N1)viruses

2.4 甲型H1N1流感病毒HA基因进化分析在17例甲型H1N1流感标本中,共有9例测序获得了病毒全基因组序列,所有毒株的8个基因节段平均测序深度为140×～47098×。HA基因进化分析结果表明,与疫苗株A/Michigan/45/2015相似,本研究所有毒株的HA基因均属于甲型H1N1病毒6B组6B.1亚组,以S84 N、S162 N和I216T氨基酸替换为特征。此外,本研究所有毒株还发生了S74R和I295 V氨基酸变异。除了A/Nanjing/2018031/2018之外,所有毒株还发生了S164T变异。各毒株之间的HA核苷酸同源性为98.1% ～100%,氨基酸同源性为97.7%～100%。所测毒株HA核苷酸与疫苗株的同源性为97.8% ～98.9%,氨基酸同源性为97.5%～99.6%。HA基因进化分析情况详见图1。

注：▲本次测序毒株；●WHO推荐疫苗株图1 甲型H1N1流感病毒HA基因系统发生树Note： ▲Strains sequenced in this study；●WHO recommended vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza A(H1N1)viruses

3 讨论

流感病毒是引起老年肺炎的主要病毒之一,研究表明,对于甲型H1N1流感而言,老年病例的病死率显著高于其他年龄段[6]。因此,了解老年甲型H1N1流感病毒性肺炎的临床特点,进一步分析其在南京地区老年人中的分子特征,对于临床诊断、疾病预防、针对性用药以及避免滥用抗生素均具有重要意义。

刘晓伟等[7]分析了86例以青壮年为主的甲型H1Nl流感病毒性肺炎患者的临床资料,只有15.1%的患者存在基础疾病。本研究发现,所有入选的老年患者至少合并有1种基础性疾病,存在1种或以上严重基础性疾病的患者比例达41.2%。高龄和基础病的存在直接影响到甲型流感的严重程度和预后,增加了临床治疗的难度[8]。《中国慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》指出,使用流感疫苗可以减少COPD患者的严重程度和死亡率,说明COPD患者很容易发生流感感染并导致死亡,在本研究中,老年流感肺炎患者的COPD合并比例高达52.9%,然而流感疫苗的接种率却为0%,所以,老年COPD患者更应该定期接种流感疫苗以预防感染。通过对临床表现分析发现,发热和呼吸系统症状最为突出,与已有报道一致[8]。23.5%的患者伴有消化道症状,低于美国所报道的比例[9],但高于国内报道的比例[10]。在实验室检查方面,超过90%的患者出现乳酸脱氢酶增高,可能与肺脏和心肌的损害有关。胸部影像表现以双肺病变为主,与以往报道一致[11],危重症患者双肺病变的比例高于重症患者,然而差异无统计学意义。本研究的样本量较小,部分结论还需要进行大样本研究进一步证实。

二代测序技术在流感病毒的鉴定及全基因组序列分析方面具有其独特的优势[12],与WHO推荐疫苗株A/Michigan/45/2015相同,本研究所测病毒的HA基因均属于甲型H1N1病毒的6B组6B.1亚组。抗原位点的变异直接影响到流感病毒的抗原漂移,与疫苗株相比,本研究所测病毒的HA蛋白发生了10处氨基酸变异,有3处发生在抗原位点上,分别为Ca抗原的H138Y变异、Cb抗原的S74R变异和Sa抗原的S164T变异,这些变异是否会影响到疫苗株的保护效果还有待进一步研究。糖基化位点的主要作用是稳定HA结构,防止HA水解的同时还可以阻碍抗体的识别,本研究中虽然大部分病毒发生了162NQS到162NQT的改变,但糖基化位点的数量并未发生增减。由于甲型H1N1病毒对烷胺类抗病毒药物普遍耐药,所以病毒是否发生对NA抑制剂的耐药尤为重要,A/Nanjing/2018029/2018毒株发生了H275Y变异,提示可能对流感病毒NA抑制剂类药物耐药从而影响治疗效果,临床资料显示,在治疗过程中,该患者的最高体温达40度,在所有患者中最高,乳酸脱氢酶的水平达1 000 U/L,C反应蛋白达122 mg/L,而且发生了呼吸衰竭,为危重症病例,推测可能与NA抑制剂的治疗效果不佳有一定关系。

虽然目前甲型H1N1流感未发生再次大流行,但是对于老年人特别是未接种流感疫苗者,很容易发生流感并发展为肺炎,预后较差。老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者多合并基础疾病,容易产生合并感染,临床工作者在诊治过程中需要密切关注这些特点。随着群体免疫压力和抗病毒药物压力的选择,甲型H1N1病毒可能在今后出现新的变异导致其抗原性和耐药性发生变化,需要对病毒的分子特征持续监测,为疾病预防和临床抗病毒治疗提供依据。

利益冲突无