副粘病毒膜融合机制的研究进展

迟苗苗 王志玉

250012济南,山东大学公共卫生学院病毒学研究室

副粘病毒是一科重要的人类致病病毒,为有包膜不分节段的单股负链RNA病毒。该科病毒包括[1]麻疹病毒(meals virus,MeV)、腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)、副流感病毒(parainfluenza viruses,PIVs)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)及亨德拉病毒(hendra viruse,HeV)和尼帕病毒(nipah viruse,NiV)等。其中的MeV只感染人类,尽管具备安全可行的疫苗,全球每年仍有超过12万的儿童受到感染而死亡。NDV可引发家禽烈性传染病,造成巨大的经济损失,还可造成人类结膜炎感染。HeV和NiV是一种新发人兽共患病的病原体,其病死率可高达90%。新发传染病监测在蝙蝠体内新发现了66种副粘病毒[1],虽然目前的致病情况尚不清楚,但具有很大的致病威胁。所以研究其致病机制和防治对策仍是当务之急,以便疫情发生时从容应对。

副粘病毒的病毒包膜与细胞膜融合后,病毒核酸-蛋白复合物释放进入靶细胞启动感染。膜融合是病毒完成细胞入侵并进行细胞间传播的重要机制。除肺病毒亚科(RSV和hMPV)外,大多数副粘病毒的膜融合过程需要融合蛋白(Fusion protein,F)和吸附蛋白的共同参与。吸附蛋白与细胞表面的受体结合后,可以激活F蛋白,后者进行一系列的构象改变来完成病毒包膜与细胞膜及细胞膜之间的融合。但是,吸附蛋白如何将受体信号传递给F蛋白,并激活F蛋白,引发细胞融合?其确切机制尚不清楚。副粘病毒膜融合发生的过程及其参与组分提示吸附蛋白、F蛋白及二者之间的相互作用可能造成了副粘病毒膜融合机制的不同,本研究从吸附蛋白及F蛋白的结构功能阐述入手,进而对比不同吸附蛋白参与的膜融合过程的机制差异,以期为该属病毒的致病研究和疫苗研发策略提供线索。

1 F蛋白

副粘病毒的F蛋白是I型跨膜糖蛋白,由N端胞外段、跨膜区、和胞内C端尾区组成,胞外段含有融合肽和疏水重复区。F蛋白最初合成的是非活化形式的蛋白前体F0,经加工修饰后被宿主细胞蛋白酶裂解为二硫键连接的F1和F2。F蛋白以三聚体形式存在,其融合中心由疏水性重复单位HRA与HRB组成,HRA位于F1的N端,HRB位于C端。F蛋白激活后,其N端邻近HRA的融合肽(fusion peptide,FP)暴露并插入靶细胞膜形成发卡形状的融合前中间体(Pre-hairpin intermediate conformation,PHI)[2]。紧接着,两个疏水重复区HR1与HR2相互结合形成6聚疏水螺旋束(Six-helix bundle,6HB),诱导膜融合[3]。虽然蛋白结构和诱导融合时的构象改变较为统一,但是不同副粘病毒的F蛋白诱导膜融合的机制存在差异。Xu等[4]研究发现,NiV的F蛋白融合前构象为F蛋白的六聚体,通过六聚体内的F蛋白间相互激活来诱导膜融合的级联反应。对于肺病毒亚科(RSV和hMPV)而言,F蛋白可能同时具有受体识别和膜融合功能,其膜融合机制更具特殊性。

2 吸附蛋白

副粘病毒的吸附蛋白根据功能和病毒来源的不同分为3类：血凝素神经氨酸酶(hemagglutininneuraminidase,HN)、麻疹病毒属的血凝素(hemagglutinin,H)和来自亨尼帕病毒的糖蛋白(glycoprotein,G)。HN/H/G均为Ⅱ型跨膜糖蛋白,胞外域包含靠近胞膜端的N端颈部和C端的球状受体结合区(receptor binding domain,RBD)。RBD区包含6个片层β折叠结构,可以识别受体,从而进行结构适应和变化。HN/H/G均为四聚体,具有相似的结构。尽管结构相对保守,副粘病毒的吸附蛋白仍有很多不同之处,例如,RSV-G和hMPV-G,比其他副粘病毒的吸附蛋白要小[4]。对多数副粘病毒而言,吸附蛋白是F激活的前提条件,但PIV5-

HN与RSV-G仅起到促进融合作用,hMPV-G对融合过程没有影响[5]。HN/H/G识别宿主细胞的受体类型不同。HN识别唾液酸,H/G识别蛋白类受体,但是RSV-G和hMPV-G可能并不参与受体识别[4]。受体类型可能决定着HN/H/G-F相互作用及其调节膜融合的过程。

3 膜融合机制

3.1 F蛋白介导的膜融合过程绝大多数的副粘病毒的F蛋白需要吸附蛋白的协同作用来完成病毒包膜与靶细胞膜的融合,进而释放遗传物质进入靶细胞,启始感染。F蛋白介导的膜融合是副粘病毒生命周期中很重要的一个环节,膜融合过程中的几个关键步骤已经被确认[5]。早期步骤包括：HN/H/G结合受体、HN/H/G的构象改变、激活F蛋白进行构象改变引发膜融合。后期步骤有：融合小孔的形成与扩大。膜融合早期,吸附蛋白结合受体激活F蛋白对于融合的起始至关重要。膜融合的后续步骤主要依靠激活后的F蛋白不可逆的构象改变来实现。

3.2 膜融合中F蛋白的构象变化随着F蛋白融合前和融合后构象的晶体结构的获取,我们对副粘病毒F蛋白介导的膜融合的过程的了解逐渐清晰。对比目前已知的F蛋白融合前后构象发现,融合前构象更像圆形,而融合后构象球状头部呈角状[5]。融合前的F蛋白,HRA由一系列短的螺旋构成,呈球状,HRB为C端颈部,通过跨膜区连着胞内尾端。一旦切割和活化,HRA区由一系列的螺旋结构转化为舒展的长107Å的三聚卷曲螺旋。该舒展状态可能是融合肽插入靶细胞膜的时刻,在电镜下观察到此时的F蛋白将两个细胞膜拉近至210Å[6]。随着融合肽插入靶细胞膜,HRB以反平行方式重新定位于HRA沟槽中,形成稳定的6HB,从而合并相邻胞膜,并促进融合孔的打开。融合孔的形成可能需要多个F蛋白进行协同构象改变来跨越膜融合的能量障碍[3]。

3.3 F-HN/G/H的相互作用与膜融合免疫共沉淀和实时荧光互补技术[7]均显示膜融合过程中二者之间存在相互作用。尽管尚未获得副粘病毒吸附蛋白与F蛋白相互作用的直观结构学数据,已获取的功能研究结果均显示这一相互作用对于副粘病毒属的融合激活很重要。

3.3.1 相互作用的区别：F-HN/G/H相互作用的细胞内发生位置、持续时间、强度等区别很大(见表1)。病毒颗粒负染电镜观察和低温电子显微镜断层成像技术结果显示,hPIV3[8]在结合受体前,细胞膜表面存在HN-F短暂的相互作用,但不足以激活F,受体结合传递信号才启动了F蛋白激活。H/G-F在受体结合前乃至合成转运过程中[9]已形成复合物,直到H/G结合受体后发生构象改变并暴露颈部的关键氨基酸,F才被激活并与H/G解离,然后F介导膜融合发生。相互作用的强度与融合活性之间的关联在不同病毒之间存在一定差异。某些HN/H/G突变体,其融合功能丧失,同时相互作用被阻断[10-13]。对于NiV和MeV,突变分析显示F-G/H相互作用强度与融合程度成负相关关系[14-15]。NDV HN颈部的第69和第77位点引入糖基化使得融合减弱也使F-HN相互作用减弱,hPIV3的H552Q突变体增强融合并伴随HN-F相互作用的增加,表明融合程度与F-HN的相互作用呈正相关[16]。但这种相关关系存在一些例外。NDV HN的颈部点突变体L97 A虽然减弱了融合程度,但是未影响F-HN的相互作用[17]；MeV H的I118C减弱了相互作用,但并未影响膜融合[12],NiV G的颈部第159位糖基化位点移除,虽然废除了融合但是未明显减弱G-F相互作用[18]。这说明相互作用的确切机制,相互作用如何与HN/G/H识别的受体信号及F诱导的膜融合相关联仍有待进一步揭示。

3.3.2 相互作用的模型：根据F-HN/G/H相互作用的区别,目前有两种解释模型[5]：夹钳模型(“dissociation” or “clamp” model)和破坏模型(“association” or“provocateur” model)。 夹钳模型认为,F蛋白同吸附蛋白在胞内相互作用,以复合物形式转运至细胞表面,当吸附蛋白结合受体后,F蛋白被释放,启动膜融合。破坏模型认为,吸附蛋白结合受体后主动引发亚稳态的融合前构象的F蛋白去稳态。去稳态和F激活均可以被加热替代,因此F-HN/H/G相互作用克服了F激活的能量障碍。两种模型最大的不同是前者认为吸附蛋白可以稳定F的融合前构象,而在破坏模型中吸附蛋白则激发融合前F蛋白的构象改变。目前的研究认为F-G/H的相互作用通过夹钳模式稳定F蛋白,而F-HN相互作用则使得F蛋白去稳态并激活引发融合。

但是当前有许多与模型假设不符的证据出现。F蛋白可以以融合前构象单独表达而不需要吸附蛋白来稳定[19-20],说明参与F-H/G/HN相互作用的融合前构象的F蛋白不需要吸附蛋白的“夹钳作用”来稳定。而且加热又可以作为外来能量激活F蛋白诱导膜融合[21],这与破坏模型中的加热可以克服亚稳态F的能量障碍的说法相一致。这些都表明识别受体前的F-HN/H/G相互作用对于稳定融合前构象并非如夹钳模型认为的那样是必须的。相反,这种识别受体前的相互作用可能对蛋白的正确折叠,胞内运输或增加可激活复合物浓度是必须的[9]。

表1 HN/H/G-F的相互作用比较Tab.1 Comparison of HN/H/G-F interaction

3.4 F蛋白的激活机制模型有人针对F激活过程总结了5种模型[5],值得注意的是这些模型并非相互独立。两个或多个模型可能适用于同一种副粘病毒。更多的结构和功能数据尤其是HN/G/H-F相互作用方面,将有助于进一步描述和证实这些模型。

3.4.1 颈部暴露模型：目前较为认可的观点是颈部暴露模型(stalk exposure model),即吸附蛋白结合受体后会暴露出颈部激活F蛋白的区域[22],这一点在多项有关截短头部的颈部吸附蛋白可以激活其同源F蛋白的研究中被证实。目前发现,F蛋白诱导的膜融合可以同样被不含头部区域的MeV H蛋白[23]、NiV G蛋白[24]、MuV HN蛋白和NDV HN蛋白诱导[22]。因此颈部激活是HN/H/G的一个共性。目前的研究已经初步定位了HN-F相互作用的区域[22],但是为什么只有特定长度的颈部可以激活F仍然不清楚[22]为什么MeV H的单独颈部引入稳定基团后才能引发融合[23]?为什么NDV HN引入二硫键稳定颈部后却抑制了融合发生[22]?都需要进一步深入研究。

与功能研究结果一致,HN的晶体学结构研究可以合理解释颈部暴露激活模型。在识别受体之前,HN/H/G的头部可以抑制F蛋白靠近其颈部的F激活区。吸附蛋白可能通过其头部相对于其颈部4HB的空间排列方式来实现这一抑制效果,类似于NDV HN蛋白头部的四聚体下垂模型(4 headsdown)的排列方式[25]。识别受体后,吸附蛋白头部结构重排,构象变得接近于PIV5 HN蛋白头部的四聚体抬举模型(4-heads up)的排列方式或PIV5 HN蛋白的二聚体抬举二聚体下垂的中间态模型(2 heads up-2 heads down)的排列方式[26]。这些构象变化使得吸附蛋白颈部的F激活区暴露,进而激活F蛋白进行构象改变并诱导膜融合。值得注意的是,在没有结合受体时,hPIV3[8]就存在“头部抬举”的HN和F的相互联系,这说明吸附蛋白的构象变化可能存在不依赖受体结合的途径,需要进一步的研究。

3.4.2 颈部暴露模型中的相互作用调节机制：深入的研究发现不同的副粘病毒的吸附蛋白HN/H/G通过不同的机制来调节颈部暴露之前F蛋白与吸附蛋白的相互靠近。与F-HN初次相互作用发生在细胞表面不同,F-G/H复合物在受体结合前甚至是转运至细胞表面过程中[9]已经存在。受体结合前出现的F-G/H复合物可以增加F-G/H相互作用的效率,同时也增加了不恰当的F蛋白激活的危险。因此其调节相对复杂。

3.4.2.1 头部抑制：最近的研究显示HN/H/G蛋白的头部可以主动抑制其颈部对F蛋白的激活。识别受体后,HN/H/G蛋白球状头部进行构象改变,暴露F激活区并解除对颈部的抑制作用,接下来,颈部进行构象改变进而引发F激活。在结合受体前的4 heads-down构象时,F-H/G存在初始相互作用可能是因为其单体在头部下垂时暴露出的颈部区域与NDV HN及PIV5 HN不同,即4 heads-down构象时,F蛋白与H/G蛋白颈部的接触程度不同于HN[24,27-28]。

该模型可以很好地解释为什么HN/G/H蛋白通过不同的位点识别不同的信号却导致一致的效应,即激活F蛋白诱导膜融合。

3.4.2.2 颈部C端近头部的连接区域：除了颈部暴露外,HN/G/H蛋白颈部近C端参与了F蛋白的激活调节[9,24,28-29]。研究显示,F-G/H的作用区相对于F-HN更为宽泛[24,30-32],但是又与HN存在线性重叠部分。H/G颈部C端近头部的连接区域含有某种结构稳定区参与调节F蛋白的激活[15,24]。结合受体前的F-G/H相互作用可能通过该区实现[28]。这一宽泛的F-H/G接触区可能为F-H/G相互作用如何被调控及F蛋白的不恰当激活如何被阻止提供研究线索。但具体的F-H/G复合物如何阻止不恰当的F-H/G相互作用发生尚需进一步探讨。

4 结语与展望

当前有关副粘病毒的膜融合机制仅限于在实验突变分析数据基础上结合吸附蛋白与F蛋白的晶体结构进行推测拟合出模型,但具体的膜融合过程尚不能被清楚地展示出来。探索不同副粘病毒膜融合的共性与差异,有赖于使用高分辨率的冷冻电镜成像技术,在病毒水平直观捕获并描述HN/G/H-F复合物的共结晶结构来阐述二者在副粘病毒感染引发的膜融合过程中发挥的具体作用。膜融合机制的深入研究将为药物靶点设计和疫苗研究奠定基础。

利益冲突无