猴痘病毒感染血清抗体ELISA检测方法的建立

任皎 叶飞 赵莉 管茜茜 赵颖 宋敬东 田厚文 谭文杰

北京102206,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

猴痘是由猴痘病毒感染引起的一种罕见、散发、天花样人兽共患传染疾病。猴痘病毒是痘病毒科正痘病毒属成员,1958年丹麦哥本哈根国家血清学研究所在对食蟹猴的痘样疾病进行研究时发现了该病毒,由此而命名。在正痘病毒属中有多种能导致人类疾病的病毒,如天花病毒(已被人类消灭)、猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒等。猴痘病毒毒力较强,但感染性和致病性均弱于天花病毒。猴痘临床症状与天花相似,但病情相对天花较轻,病死率为1% ～10%。主要表现为皮肤出现类似天花的水疱或脓疱,有发热、头痛、全身不适、浅表淋巴结肿大等前驱症状。早期出现的淋巴结肿大是猴痘区别于天花的一个特征。在当今,全球天花已被消灭三十多年,而猴痘病毒依然存在于自然界中,威胁着人类健康[1]。

猴痘的病原猴痘病毒目前发现仅分布在非洲国家热带雨林地区,其首要宿主为啮齿类动物。猴痘病毒1970年才在刚果民主共和国首次发现感染人类,至今绝大多数病例都发生于刚果盆地和西部非洲的农村地区,其中发生最多的是在刚果民主共和国。然而,在2003美国因进口非洲宠物鼠,引发了5个州共47例猴痘感染者的疫情[2],这是首次出现的非洲大陆之外的猴痘流行报道,说明在全球旅游和贸易一体化时代该病可以跨越自然疫源区的地理界限迅速蔓延。最近几年中西非猴痘疫情较为活跃,如2017年3月,刚果(布)地区暴发20例猴痘病例,死亡 3例[3]；2017年 9月至 2018年 9月WHO网站报告尼日利亚269例猴痘疑似病,115例实验室确诊病例,病死7例[4]。2018年9月英国首次报道了猴痘输入病例2例[5]。虽然目前我国还没有发现猴痘输入性病例,也没有在动物宿主中发现该病毒,但随着我国对非贸易以及非洲务工人员和旅游者人数的日益增多,客观上加大了猴痘疫情输入风险。我国在2006年就建立了猴痘病毒特异的实时荧光定量PCR检测方法,还缺乏抗体检测的方法,本研究参考国外学者关于人猴痘病毒感染血清抗体检测相关研究结果[6-7],合成2个猴痘特有的多肽抗原,通过2017年我国在塞拉里昂-中国友好生物安全实验室的1例猴痘病毒感染者血清,初步建立了猴痘病毒感染血清IgG抗体的ELISA检测方法,旨在为猴痘的流行病学研究和临床辅助诊断提供技术支持；为我国应对可能出现的猴痘疫情以及生物反恐提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞痘苗病毒天坛株(TK+)来自原卫生部药品生物制品检定所,批号7601,由本室保存。143TK―细胞(人骨髓瘤细胞)由上海生物化学研究所惠赠,购自美国标准培养物保存中心(ATCC)。

1.2 猴痘多肽来源于猴痘病毒B21R蛋白的B21R179/180多肽(氨基酸序列：VAEALNDMF KEFDKNVSAIIIKEEDNYLNS)和B21R185/186多肽(氨基酸序列：RNKYRTRKYEIMKYDNMSIKSDHHD SLETV)的合成及与BSA的偶联均由北京中科亚光生物科技有限公司完成,各10 mg,纯度大于90%。

1.3 血清样品正常人血清(成年人体检血清)30份,巨细胞病毒(CMV)感染者恢复期血清1份,痘苗病毒天坛株实验室感染者恢复期血清1份(RENVV-30),痘苗病毒李斯特株实验室感染者恢复期血清1份(ZZ-VV-60),2017年塞拉利昂猴痘患者发病后12 d和55 d血清各一份(SLLA-D15,SLLAD55),以上血清均由本室保存。

1.4 猴痘病毒血清抗体检测用PBS配制含B21R179/180BSA和B21R185/186BSA混合二肽(浓度均为500 ng/ml)的抗原包被液,酶标板每孔加入100μl,4℃过夜包被。用PBST洗板三次拍干后,每孔加100μl含10%小牛血清的PBS,37℃封闭1 h。洗板后用抗体稀释液(含10%山羊血清的PBS)将待检血清作倍比稀释,起始稀释度为1∶50,100μl/孔,37℃孵育1 h。洗板拍干后分别加入1∶20 000稀释的HRP标记的羊抗人IgG二抗,37℃孵育1 h,洗板加入TMB底物溶液100μl/孔,室温暗处放置5～10 min左右,硫酸终止反应,450 nm测OD值。以正常人血清为阴性对照,在相同稀释度情况下实验组血清测得的OD值等于或大于2.1倍正常人血清的OD值时定义为阳性,用血清稀释度表示,相反则定义为阴性。

1.5 正痘病毒血清抗体ELISA检测痘苗病毒抗原的制备：痘苗病毒天坛株按0.01 PFU/细胞感染143TK―细胞,加入含2%胎牛血清的培养基,待细胞全病变后离心收集细胞,冻融3次,超声波粉碎后离心去除细胞碎片,收集上清用36%蔗糖12 000×g超速离心纯化病毒,沉淀用适量的PBS悬起,分装至冻存管,用免疫噬斑染色法测定病毒滴度,-80℃保存。以纯化的痘苗病毒包被酶标板(每孔106PFU)[11],4℃包被过夜,倒尽板孔液体后 PBS洗涤液3次,含10%山羊血清的PBS封闭37℃1 h,加入不同稀释度待测血清,37℃作用1 h,其余步骤同1.4。

2 结果

2.1 猴痘抗原特异性鉴定为了鉴定合成的B21R179/180-BSA、B21R185/186-BSA抗原的特异性和抗原活性,以上述混合二肽作为包被抗原(抗原包被量200 ng,每种肽100 ng),选择正常人血清(成人体检血清)、痘苗病毒感染者恢复期血清(REN-VV-30、ZZ-VV-60)、CMV 病毒感染者恢复期血清以及塞拉利昂猴痘患者血清(SLLA-D12,SLLA-D55),通过间接ELISA方法对上述血清进行猴痘IgG抗体的检测,从而对肽的特异性进行初步评价。由图1可看出,B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA猴痘多肽混合抗原与塞拉利昂猴痘患者的2份血清在血清稀释度为1∶50-1∶200之间时反应均很强,且OD值随血清随稀释度的增大而逐渐降低,而正常人血清、痘苗病毒感染者血清和CMV病毒感染者血清与B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA混合猴痘多肽抗原呈现弱的反应,由此说明 B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA猴痘混合肽抗原与猴痘病毒IgG抗体具有特异性反应。

图1 猴痘多肽抗原特异性鉴定结果Fig.1 Identification of the specificity of peptides antigen by ELISA

2.2 猴痘 B21R179/180-BSA和 B21R185/186-BSA混合肽抗原包被量的优化将B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA二肽抗原用PBS包被液,分别以 25 ng、50 ng、100 ng、200 ng 包被酶标板孔,正常人血清和塞拉利昂猴痘确诊患者血清按1∶50稀释,二抗从1∶5 000开始倍比稀释,从图2可看出,根据不同抗原包被量在不同二抗稀释度下的塞拉利昂猴痘患者血清与正常人血清的OD比值(P/N值)以及正常人血清的OD值综合分析,抗原的最佳包被量为100 ng(二肽各含50 ng),二抗稀释浓度为1∶20 000。

图2 多肽抗原包被量优化Fig.2 Optimal quantity of peptides antigen for coating micro-plate

2.3 猴痘病毒血清IgG抗体检测cut-off值确定及样品检测以上述优化条件(100 ng的B21R179/180-BSA、B21R185/186-BSA猴痘混合肽抗原包被,二抗1∶20 000稀释)对正常人血清库中随机抽取30份血清进行抗原本底反应检测,同时对塞拉利昂猴痘患者血清进行检测。如图3所示,在血清稀释度为1∶50时,猴痘特异性多肽抗原的本底反应OD均值为0.187,以阴性血清OD值的2.1倍设为ELISA检测的阴阳性判断标准,因此cut-off值为0.393。从图4 A可以看出,根据此cut off值判断塞拉利昂猴痘患者双份血清的检测结果,IgG抗体均呈强阳性反应(OD值大于2)。从图4B可以看出,在感染后12 d的血清,与感染后55 d的血清抗体水平相近,滴度为 1∶6400。

图3 ELISA检测正常人血清及cut-off值确定Fig.3 Detection of antibodies in normal serum samples by ELISA and determination of cut-off value

2.4 塞拉利昂猴痘患者血清正痘IgG抗体检测通过以痘苗病毒为包被抗原的正痘病毒血清抗体ELISA检测,2017年塞拉利昂猴痘确诊患者发病后12 d和55 d血清(SLLA-D15,SLLA-D55)均能检测到正痘IgG 抗体,滴度分别为1∶200、1∶800。 由此可见塞拉利昂猴痘患者血清正痘IgG抗体检测结果是与基于猴痘多肽抗原的猴痘病毒IgG抗体检测结果相符的。

3 讨论

A：血清1：50稀释时检测OD值；B抗体滴度检测图4 猴痘感染者血清IgG抗体检测结果A：OD value for detection of serum of 1∶50 dilution； B：Detection of antibody titreFig.4 Detection of IgG antibody against monkey-pox virus in serum samples collected from patient infected by monkey-pox virus

猴痘病毒感染与天花病毒感染相似,经常被误诊为鸡痘(由水痘-带状疱疹病毒感染引起)[8-9],导致无法依靠临床症状来确诊猴痘,特别是曾经接种过天花疫苗的人,再感染猴痘病毒后临床症状轻微甚至无临床症状[9]；Jezek等[10]报道初次感染猴痘病毒后并没有典型的临床症状如出疹。此外,也有文献报道,猴痘病毒西非毒株毒力较刚果盆地毒株弱,临床症状较轻。目前国际上普遍采用的猴痘病毒感染确诊判断方法为美国CDC官网[4]公布的：临床症状加流行病学背景和实验室检测三者结合。实验室检测推荐的方法是PCR,具有高度的灵敏性。然而,这种方法严格依赖于感染期病毒的存在,同时也依赖于临床样品的正确采集、储存。这些都限制了单一PCR诊断的准确性,因此二种或多种方法的联合使用对于提供准确的实验室检测诊断是必要的。有研究发现正痘病毒的IgG抗体最早在出疹后2 d就可检出,因此血清IgG抗体的检测窗口期可以从出疹几天到感染恢复后几十年。值得一提的是作为临床患者的猴痘病毒感染实验室确诊方法,单份血清标本IgG抗体阳性不能确诊猴痘病毒感染,单份标本抗体检测阳性时,仅可临床诊断为疑似或可能病例,确诊需要急性期和恢复期双份血清标本,恢复期IgG抗体滴度较急性期有4倍或以上升高。

本研究通过与塞拉里昂-中国友好生物安全实验室合作,利用2017年3月塞拉里昂1份猴痘感染病例的血清对合成的猴痘病毒混合二肽抗原进行了特异性和敏感性评价,初步建立了猴痘病毒感染血清IgG抗体的间接ELISA检测方法。该方法有较好特异性,且操作简便,对仪器设备要求不高,适于大规模流行病区高危人群的血清流行病学调查,以及作为实验室PCR方法的联合检测诊断。但由于猴痘感染血清标本很有限,本研究中只根据文献研究中得出的最佳混合肽抗原进行包被检测[6-7],没有将2个肽分别作为包被抗原的血清检测结果进行比较,有待于应用更多猴痘感染病例血清进行进一步的验证和优化。

利益冲突无