玉米油中植物甾醇对自由基的清除作用及应用展望

□ 李昌璞 佳乐宝食品股份有限公司

植物甾醇是植物中的一种活性成分，在结构上与动物性甾醇如胆甾醇相似。其广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，也存在于其他植物性食物如蔬菜水果中[1]。本次实验，将从玉米油中提取植物甾醇并测定玉米油中植物甾醇的含量，随后将植物甾醇提取液与自由基混合，通过自由基的改变量以期验证植物甾醇抗氧化能力。

1 实验试剂、仪器及材料

1.1 试剂

胆甾醇（标准品，北京盈泽纳辛化工技术研究院）、2,3-DHBA（标准品，北京盈泽纳辛化工技术研究院）、2,5-DHBA（标准品，北京盈泽纳辛化工技术研究院）、三氯甲烷（色谱纯，默克生命科学上海有限公司）、无水乙醇（色谱纯， 默克生命科学上海有限公司）、过氧化氢溶液（分析纯）、硫酸亚铁（分析纯）、水杨酸（分析纯）、甲醇（色谱纯， 默克生命科学上海有限公司）、丙酮（色谱纯）、默克生命科学上海有限公司）、冰乙酸（分析纯）、乙酸钠（分析纯）、乙酸酐（分析纯）、吡啶（分析纯）。

1.2 仪器

微波炉；电子天平（型号：MS105，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅；循环水式真空；高效液相色谱仪（型号：HPLC1260，安捷伦科技（中国）有限公司）、配荧光检测器；气相色谱仪（型号：GC7890B，安捷伦科技（中国）有限公司），配备氢离子火焰检测器；酸度计。

1.3 材料

玉米油：佳乐宝食品股份有限公司。

2 方法

2.1 植物甾醇的提取

精确称取1.00 g玉米油于100 mL的平底蒸发瓶中，按1∶12料液比分别加入乙醇溶液，设定微波提取温度50 ℃、功率为200 W，提取时间1 min[2]；将蒸发瓶接在旋转蒸发仪上,于50 ℃水浴中减压蒸馏至近干，用三氯甲烷分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，溶液过0.22 μm有机系滤膜后，进行甾醇含量分析。

2.2 植物甾醇含量分析

2.2.1 样品分析步骤

准确称取样品0.3 g及内标胆甾醇0.1 g（精确至0.000 1 g），加入15 mL乙酸酐和吡啶混合物（1+3），在水浴中加热30 min，在减压条件下脱溶，加20 mL三氯甲烷溶解残留物。

2.2.2 气相色谱条件色谱柱

SE—54毛细管柱，长50 m、内径0.25 mm；柱温245 ℃；检测器温度320 ℃；进样器温度320 ℃；载气流速30 mL/min；分流比1/100；进样量 1 μL。

2.2.3 测定

将2.2.1中待测样品注入气相色谱仪中，根据标准色谱峰响应面积定量测定。

2.3 羟基自由基实验

2.3.1 标准工作曲线

分别配制一系列浓度在10 nmol/L～100 nmol/L范围内的2,3-DHBA标准溶液、1nmol/L～10nmol/L范围内的2,5-DHBA标准溶液和1nmol/L～10nmol/L范围内的水杨酸标准溶液，用HPLC进行分析，测定相应的荧光信号，以相应组分的色谱峰面积（S）对其浓度（C）进行线性回归，得到标准工作曲线。

2.3.2 色谱条件

流动相为30 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值4.9），流速为1.0 mL/min，水杨酸、2,3-DHBA和2,5-DHBA的激发波长均为237 nm，荧光发射波长分别为405 nm、425 nm和431 nm。

2.3.3 测定

（1）依次分别吸取9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、8.8 mmol/L过氧化氢溶液1 mL于10 mL容量瓶中，将标记好的样品涡旋30 s混匀后，加入9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，在36 ℃恒温水浴中反应15 min后分别测定样品中2,3-DHBA和2,5-DHBA含量C。

（2）在（1）所述样品中依次加入2.1制取植物甾醇样品的不同浓度，在36 ℃恒温水浴中反应15 min后，测定其中2,3-DHBA和2,5-DHBA含量X。

（3）清除率K。

3 结果与分析

3.1 植物甾醇的清除羟基自由基实验研究

从图1中可见，玉米油中提取的植物甾醇对自由基有明显的抑制作用，实验结果表明，植物甾醇浓度与羟自由基的清除作用强度有明显的量效关系。

图1 羟基自由基清除率

鉴于本次所使用的植物甾醇为玉米油脂中的粗提取物，并没有针对单种类植物甾醇的抗氧化性进行实验，植物甾醇抗氧化作用的详细机制和原理，有待进一步探究。如黄滢璋等所言，植物甾醇主要来源于植物油脂的下脚料，本身无毒性，具有乳化性和稳定性等优点，其抗氧化作用优于BHT[3]。

3.2 植物甾醇的应用展望

3.2.1 食品/保健食品

作为天然抗氧化物，植物甾醇将在食品行业里发挥更多能力，鉴于其良好的脂溶性，其有助于即食肉制品、油脂制品的效期延长，亦可作为日常食用的其他脂类含量丰富的食品。在提高效期的同时，由于其独特的降固醇的生理特性，也会降低胆固醇的吸收。

3.2.2 药品

现已有以植物甾醇为主成分的临床药物用于动脉粥样硬化、高血脂症、冠状动脉硬化性心脏病等心血管障碍的防治。然而，近40年来，植物甾醇在抗心血管疾病方面的核心课题仍是与胆固醇的拮抗机制，进而深入到它与血浆中其他成分的关联[4]。

3.2.3 化妆品

在化妆品工业中，因植物甾醇有较强的渗透性，可保持皮肤表面的水分，促进皮肤的新陈代谢，抑制皮肤炎症，防止皮肤老化，防晒等，还有生发、养发之效能，被广泛用于生产面膜、保湿霜、浴液、头发保湿剂、洗发液、指甲油等护肤和美容制品[5]。

3.2.4 禽畜饲料添加剂

植物甾醇可作为肝功能改善剂，改善受损害的肝功能状况，同时还可作为肝功能障碍的预防剂，且具有毒性低的特点。植物甾醇可作为饲料添加剂，能促进动物生长，增进健康，提高产量，对于降低成本、提高养殖经济效益有积极作用。作为一种新型功能性添加剂，植物甾醇在饲料工业中具有广阔的应用前景，其应用研究还需做大量而深入的研究[6]。

3.2.5 植物甾醇的提取开发技术

现阶段主要提取技术依旧是主要来源于食用油脂工艺中如油脚等大量因精炼产生的工艺副产品，通过重结晶法[7]、络合法[8]等大规模工业生产工艺进行提纯。实验室内植物甾醇精制方面，分子蒸馏技术[9]及活性酶技术[10]都已十分成熟。鉴于现阶段生物技术发展迅速，通过微生物发酵[11]的植物甾醇提纯的技术也将会很快成熟并实现工业规模生产。

4 结语

自1953年，通过试验获知摄入植物甾醇对高胆固醇患者可有效降低胆固醇，针对植物甾醇生理功效的研究就从未停止。国内于20世纪80年代开始有针对性地对植物甾醇的理化性质和应用展开研究。进入高速发展的今天，诸如植物甾醇等天然营养物质引起人们越来越多的关注，这也从侧面推动了相关方面研究工作的进展。植物甾醇的广泛应用提高了其经济价值，开发出简单有效的生产工艺，研究其新的用途，才能参与国际竞争，并取得较高的社会效益和经济效益[12]。