植物乳杆菌活菌计数方法的优化

□ 王雅丽 张晓蕊 范翠翠 徐长隆 汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司

乳酸菌是一类能发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，其大量存在于胃肠道中，是人体肠道内的益生菌群，其可以代谢产生有机酸、细菌素、过氧化氢和双乙酰等多种天然抑菌物质，对人体健康有很大的促进作用。大部分乳酸菌产品中的乳酸菌数量基数非常高，可达到1010CFU/g。乳酸菌产品由于其特异性、多样性，敏感性导致其易受环境影响，因此检测过程中的细微差别都可能影响活菌计数的稳定性和准确性。本实验从培养基配方的筛选、培养时间及培养方式三个方面设计，优化出一种节约成本、缩短试验周期的检验方法，可广泛用于实验室研发及车间生产；同时，加强乳酸菌相关产品的检测，对于提高产品质量，保护消费者的利益及健康，都有重要的意义[1-2]。

1 材料和设备

1.1 菌种

植物乳杆菌HCS03-007：汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司分离，实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 合成MRS

合成MRS购于北京奥博星生物技术有限公司。

1.2.2 自配MRS

蛋白胨1 0 g，牛肉粉5g，酵母粉4g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三胺2g，醋酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，调节pH值6.2，琼脂15g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20 min。

1.2.3 番茄汁MRS

在自配MRS中添加1%的番茄汁（番茄汁制备方法：新鲜的番茄洗净，称取100g于榨汁机内粉碎充分，煮沸5min，三层纱布过滤后，用水补至200mL）。

1.2.4 pH6.0/6.4MRS

自配MRS调节pH值6.0/6.4。

1.3 实验器皿

300mL锥形瓶、移液枪、10mL离心管、玻璃平皿等。

1.4 仪器与设备

电子天平、pH计、蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、厌氧培养袋、产气包等。

2 实验方法

2.1 实验设计

本试验通过单因素实验，分别考察培养基配方、培养时间、需氧型等方面对HCS03-007植物乳杆菌进行计数，挑选合适条件对以后实验进行优化。

2.2 操作步骤

2.2.1 菌种活化

将公司实验室-80℃保存的冻存管HCS03-007进行活化，以10%的接种量接种，传代三次，得到的菌种冰箱保存备用。

2.2.2 系列稀释及计数培养

将上述活化后的第三代菌液用0.85%的无菌生理盐水进行梯度稀释，根据对样品浓度的估计，选择10-6、10-7的样液加入相应的培养基，进行需氧和厌氧培养，48h计数一次，记录结果，继续培养至72h，计数并记录结果。

3 结果与分析

实验数据详见表1。

根据表1可知，HCS03-007植物乳杆菌培养48h与72 h，实验结果完全没有变化，故确定计数实验采取48h培养；HCS03-007植物乳杆菌在需氧、厌氧条件下计数结果差异不显著，说明植物乳杆菌在培养过程中，对氧气的敏感度低，故确定计数实验采取需氧培养；HCS03-007植物乳杆菌在合成培养基中计数结果最佳，其次为番茄汁MRS，且合成培养基中的结果仅为番茄汁MRS的1.05倍，差异不显著，考虑到成本因素，故确定计数实验培养基为番茄汁MRS。

表1 植物乳杆菌HCS03-007菌落计数结果

4 结论

本实验确定了适用于植物乳杆菌计数的培养基为添加1%番茄汁、pH值为6.2的自配MRS培养基，需氧培养48 h进行计数。本实验初步对植物乳杆菌计数方法进行了优化，后续还可开展试验操作角度的优化，如培养基灌注方式，点样或涂布计数等，以期在处理大量样品时，找到一种有效、简单、快速和相对经济的活菌计数方法。