60Co辐照对柴葛退热散主要有效成分含量及灭菌效果的影响

张 强, 刘亮镜, 秦亚东* (. 安徽中医药高等专科学校 药学系，安徽 芜湖 400；. 芜湖市中医医院 制剂室，安徽 芜湖 4003)

柴葛退热散为芜湖市中医医院院内协定处方制剂，临床疗效确切。本方由柴胡、葛根、黄芩、升麻、薄荷、芦根、甘草、鸭跖草、石膏、知母共十味中药组成，具有清热解毒，解肌退热的功效，临床主要用于恶寒发热、头身疼痛、咽痛烦渴等外感发热的治疗。

柴葛退热散工艺为净中药材粉碎，按内服散剂微生物控制要求需要进一步灭菌处理，2015版《中国药典》中就明确规定了散剂的微生物限度检查项目。现常用的控制微生物限度的方法有干热灭菌、湿热灭菌、微波灭菌、紫外灭菌法等[1-2]。由于本方中薄荷含有挥发性的薄荷脑成分，导致上述灭菌方法往往不能满足中药制剂中多种药材同时灭菌的条件，增加了中药制剂微生物限度控制的难度。60Co辐照灭菌是在常温下进行灭菌，避免了高温条件下挥发性成分的挥发，一般认为对制剂中薄荷脑等挥发性成分不造成影响，另外卫生部1997年38号文件“允许辐照中药材”目录发现柴葛退热散绝大多数成分是适合60Co辐照灭菌。李计萍[3]在讨论γ射线辐照灭菌的问题时指出大多数仅以灭菌效果为考察指标，未对辐照剂量和前后有效性等进行深入研究，因此辐照剂量与灭菌效果以及辐照前后可测定的主要有效成分含量有无变化是考察的重点[4-6]。

为了保证柴葛退热散制剂工艺及质量，选用60Co辐照对柴葛退热散中微生物限度控制进行研究，通过不同强度的60Co-γ射线辐照，比较辐照前后柴葛退热散中主要有效成分的化学变化及其微生物含量变化，判断柴葛退热散是否适宜60Co辐照灭菌，从而为其质量标准的制定提供理论支持，确保临床用药安全有效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂 葛根素对照品(批号110752-201313)、甘草苷对照品(批号 111610-201106)、黄芩苷对照品(批号 110715-201318)购自中国食品药品检定研究院。三氯甲烷、石油醚(30～60℃)、甲酸乙酯、甲酸、甲苯、冰醋酸等为分析纯，磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.1.2 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、Mettler Toledo XP205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)、UPS-11-10T优普系列超纯水器(成都优普净化科技有限公司)、BFT-4型60℃辐照装置(北京三强核力辐照工程技术有限公司)、SPX-150B-Z生化培养箱(上海书培实验设备有限公司)、MJX-160B-Z霉菌培养箱(上海右一仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 柴葛退热散制备 按柴葛退热散处方中各药材规定比例，选取药材饮片，分别称取各药材饮片共计10 kg，将药材饮片混合后用粉碎机粉碎，过65目筛，未过筛的粗粉继续粉碎，直至完全通过筛网，即得柴葛退热散混合粉末。

1.2.2 辐照灭菌 样品辐照灭菌由南京喜悦辐照有限公司进行辐照处理，辐照源为60Co，辐照剂量分别为 1 kGy、2 kGy、3 kGy。

1.2.3 辐照前后性状比较 通过日光下目视、口尝、鼻嗅对柴葛退热散外观聚集状态、色泽、气味、味道进行直观判断。

1.2.4 对照品溶液的制备 取葛根素、黄芩苷和甘草苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成葛根素26.72 μg/mL、黄芩苷432.5 μg/mL、甘草苷16.81 μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.5 供试品溶液的制备 精密称取本品约5.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30% 乙醇100 mL，称定重量，水浴回流30 min，放冷，再称定，用30%乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液即得。

1.2.6 葛根素、甘草苷和黄芩苷的含量测定 精密称取不同批号(150825、150826、150827)柴葛退热散(60Co辐照前)、柴葛退热散(60Co辐照1 kGy)、柴葛退热散(60Co辐照2 kGy)、柴葛退热散(60Co辐照3 kGy)各约5.0 g，按“1.2.5”项下方法处理样品。参照课题组前期确定测定方法：色谱柱为Agilent ZORBA SB-C18(150×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-甲醇-0.1%磷酸(V/V)为流动相，1.0 mL/min，检测波长237 nm，柱温30℃，梯度洗脱[7]，分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录数据，平行测定3次，按外标一点法计算平均含量。

1.2.7 微生物检查 按照2015年版《中国药典》第四部通则中非无菌产品微生物限度检查[8]：通则 1105(微生物计数法)、通则1106(控制菌检查法)及通则 1107(非无菌药品微生物限度标准)检查60Co辐照前后柴葛退热散需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数、大肠埃希菌数和沙门菌数的变化。

2 结果与分析

2.1 辐照前后柴葛退热散性状比较

辐照前后柴葛退热散样品的外观、聚集状态、色泽、嗅、味均未发生明显变化,说明60Co辐照对柴葛退热散性状没有明显影响，60Co辐照前后柴葛退热散性状未见明显改变。

2.2 辐照前后化学成分及葛根素、黄芩苷和甘草苷含量比较

在同一色谱条件下，60Co辐照前后HPLC色谱图谱进行比较，发现辐照前后主要有效成份HPLC图谱基本一致，说明辐照前后柴葛退热散化学成分无明显变化；依据葛根素、黄芩苷和甘草苷对照品和辐照前后样品HPLC图谱中三成分的保留时间tR及在线DAD扫描紫外光谱图完全一致(图1)[9]。因此辐照前后柴葛退热散中葛根素、黄芩苷和甘草苷化学成分均未发生变化。

图1 柴葛退热散辐照前HPLC图谱(1-A)；柴葛退热散辐照后HPLC图谱(1-B)；混合对照品HPLC图谱(1-C)(1.葛根素;2.甘草苷;3.黄芩苷)。

Fig.1 HPLC chromatograms of Chaige tuire powder before irradiation(1-A);HPLC chromatograms of Chaige tuire powder after e irradiation(1-B);HPLC chromatograms of reference substance mixture(1.puerarin;2. liquiritin;3. baicalin).

由表1可以看出辐照前后葛根素和黄芩苷的含量最大波动在2%以内；尽管甘草苷含量较低，积分误差大，然辐照前后甘草苷含量最大波动仍小于5%，说明辐照剂量低于3 kGy时对柴葛退热散中主要成分葛根素、甘草苷和黄芩苷的含量影响可以忽略不计。辐照后各成分与辐照前含量无显著性差异(P>0.05)。

表1 柴葛退热散辐照前后含量及微生物比较(n=3)Table 1 Comparison of contents and microorganisms before and after irradiation for Chaige Tuire powder(n=3)

注：a:批号150825；b:批号150826；c:批号150827。

Note：a represents batch number 150825；b represents batch number150826；c represents batch number150827.

2.3 辐照前后微生物含量比较

通过对三批柴葛退热散分别进行辐照前、1 kGy剂量60Co辐照、2 kGy剂量60Co辐照、3kGy剂量60Co辐照的样品按照1.2.7项下进行微生物限度检查，检查结果(见表2)发现辐照前柴葛退热散的微生物数量高于2015年版《中国药典》[10]内服散剂项下微生物限量，不符合药典要求。依据表2中的结果，对同批柴葛退热散在辐照前和不同剂量60Co辐照后微生物含量对比，发现三批样品辐照后微生物含量均较辐照前显著下降，表现为辐照后的需氧菌总数均在辐照前的20%以内，辐照后的霉菌及酵母菌总数均在辐照前的25%以内，且需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数随60Co辐照剂量的增加逐渐递减；当60Co辐照剂量为2 kGy时，霉菌及酵母菌均已无法检出，检测结果呈现零的状态；当辐照剂量为3 kGy时，不但霉菌和酵母菌均未检出，需氧菌总数也已不足辐照前的1%，大肠埃希菌和沙门菌均未在各批样品中检出。辐照后各成分与辐照前含量具显著性差异(P<0.05)。研究结果发现，当辐照剂量为3 kGy时即可保证柴葛退热散微生物含量符合2015年版《中国药典》内服散剂项下微生物限度要求。

表2 柴葛退热散辐照前后含量及微生物比较(n=3)Table 2 Comparison of contents and microorganisms before and after irradiation for Chaige Tuire powder(n=3)

续表2Table 2 Continued

注：a:批号150825、b:批号150826、c:批号150827、N表示未检出;△表示P<0.05。

Note：a represents batch number 150825;b represents batch number 150826; c represents batch number 150827; N indicates that it is not detected;△indicateP<0.05.

3 结论与讨论

柴葛退热散属于治疗表证外感发热，研究发现，柴葛退热散中的主要有效成分葛根素、甘草苷和黄芩苷的含量在60Co辐照前后无明显变化，而微生物含量在60Co辐照后明显减少，尤其在3 kGy辐照剂量时，能够较好地抑制微生物的生长，控制微生物的限度，符合国家药典散剂项下的微生物限量标准。60Co辐照灭菌与紫外灭菌相比较具有穿透力强的特点，适合大批量的药材灭菌；与湿热灭菌比较，能够在常温下进行灭菌，不影响处方中药物的挥发性成分及不耐热成分，60Co辐照灭菌主要是通过γ射线损坏生物体的DNA和RNA，使细菌失去蛋白质合成和遗传功能而死亡，具有安全、有效、经济、绿色、节能等特点，操作简单、方便，适合含有多种药物的中药制剂的灭菌处理。

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