p—CHEK2在浸润性乳腺癌中的表达和临床意义

胡晓华 王宁 王雅杰

[摘要] 目的 研究在浸潤性乳腺癌组织中磷酸化细胞周期检查点激酶2（p-CHEK2Thr68）的表达情况，并探讨其临床意义。 方法 收集2007年1月～2011年12月第二军医大学附属长海医院及黄浦区中心医院289例乳腺癌改良根治术后病理标本。采用免疫组化方法检测组织中p-CHEK2Thr68的表达情况，分析其与临床病理参数之间的关系。 结果 在乳腺癌组织中p-CHEK2Thr68阳性表达率为26.0%（75/289），癌旁组织的阳性表达率为0%，差异有统计学意义（P < 0.05）。p-CHEK2Thr68表达率在无淋巴结转移组高于有淋巴结转移组，在ER阴性组高于ER阳性组，PR阴性组高于PR阳性组，HER2阴性组高于HER2阳性组，三阴性乳腺癌组高于非三阴性乳腺癌组，差异有统计学意义（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表达与患者的发病年龄、月经状态、组织分级、肿瘤大小、TNM分期、P53状态无关（P > 0.05）。 结论 采用免疫组化方法检测乳腺癌组织中p-CHEK2Thr68的表达情况以观察其生物学行为，将有助于制订乳腺癌患者的个体化治疗方案。

[关键词] 乳腺癌；p-CHEK2；免疫组织化学

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0092-04

Expression and clinical significance of p-CHEK2 in invasive breast cancer

HU Xiaohua WANG Ning WANG Yajie

Department of Oncology， Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To detect protein expression of phosphorylated chekpoint kinase 2 （P-CHEK2Thr68） in invasive breast cancer tissues and reveal the relevant clinical significance. Methods Totally 289 cases of invasive ductal breast cancer tissues were collected from January 2007 to December 2011 in Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University and Shanghai Huangpu District Central Hospital. The expression of p-CHEK2Thr68 was analyzed by immunohistochemistry， and its relationship with clinicopathological parameters was analyzed. Results The positive expression rate of p-CHEK2Thr68 in breast cancer tissues was 26.0% （75/289）， the positive expression rate of the adjacent tissues was 0%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. P-CHEK2Thr68 expression rate in the non-lymph node metastasis group was higher than the lymph node metastasis group， the ER negative group was higher than the ER positive group， the PR negative group was higher than the PR positive group， the HER2 negative group was higher than the HER2 positive group. P-CHEK2Thr68 expression rate in the tri-negative breast cancer group was higher than non-tri-negative breast cancer group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no relationships between p-CHEK2Thr68 expression and the age， menstrual status， histological grade， pathological type， tumor size， TNM stage and p53 status. Conclusion Detection of p-CHEK2Thr68 protein expression by immunohistochemistry may help to investigate the biological behavior of invasive breast cancer and to develop individualized treatment strategy.

[Key words] Breast cancer； P-CHEK2； Immunohistochemistry

乳腺癌是当今世界范围内危害女性健康的恶性肿瘤之一，发病率和病死率在发展中国家逐年上升，成为当前社会重大的公共卫生问题[1]。细胞周期检测点激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHEK2）是由抑癌基因CHEK2编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在组织细胞DNA损伤修复通路中，CHEK2是细胞DNA双链断裂损伤信号转导中的一个重要成员，其关键氨基酸残基发生磷酸化后形成p-CHEK2Thr68，通过检查点机制激活下游相关分子以调节细胞周期，同时激活修复相关基因使DNA损伤得以修复[2]。本研究采用乳腺癌组织芯片，通过免疫组化方法了解乳腺癌组织中p-CHEK2Thr68的表达状况，进而分析临床病理参数与其相关性，并初步探讨其临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2007年1月～2011年12月第二军医大学附属长海医院及黄浦区中心医院289例乳腺癌改良根治术后病理标本。经甲醛固定、石蜡包埋后构建组织芯片4张。纳入研究患者均为女性，年龄31～85岁，未绝经患者119例，绝经患者170例。肿瘤直径≤ 2 cm共106例，肿瘤直径> 2 cm共183例；组织学分级Ⅰ～Ⅱ级202例，Ⅲ级87例；区域淋巴结转移阳性106例，阴性183例；ER阳性145例，ER阴性44例；PR阳性172例，PR阴性117例；HER2阳性176例，HER2阴性113例。按照AJCC（american joint committee on cancer）乳腺癌TNM分期系统，I期70例，Ⅱ～Ⅲ期219例；ER、PR、HER2均阴性的三阴性乳腺癌患者51例。术后病理确诊为单侧乳房原发性乳腺癌，排除远处转移及炎性乳腺癌，未进行过术前放疗、化疗及内分泌和分子靶向治疗，均行腋淋巴结清扫，术后病理进行组织学分级和P53、ER、PR、HER2免疫组化检测。90例经同期病理确诊的乳腺癌旁组织进行对照，按相同方法制成组织芯片2张。

1.2 试剂和方法

兔抗人单克隆p-CHEK2Thr68抗体购自Cell Signaling Technology 公司，采用SP免疫组化法检测p-CHEK2Thr68表达。标本病理诊断经笔者医院两位以上病理科医师确定。免疫组化检测按照试剂盒说明书要求操作，经脱蜡至水、pH6.0柠檬酸盐高压锅热处理抗原修复、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，分别加一抗、二抗、DAB显色、苏木精复染。用已知p-CHEK2Thr68阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准

免疫组化染色结果均由两位病理科医师盲态评估确定。p-CHEK2Thr68表达定位于细胞核，结果判定采用二级计分法，按细胞核染色强度分为：不着色（0分）、淡黄色（1分）、棕黄色（2分）、棕褐色（3分）；按阳性细胞百分率分别为：≤ 5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。结果综合判定取二者分值之积：0～4分判定为p-CHEK2Thr68阴性，5～12分判定为p-CHEK2阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件行数据处理，p-CHEK2Thr68蛋白表达与病理参数相关性的比较采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-CHEK2Thr68在乳腺癌组织中及癌旁组织中的表达

本研究观察到在乳腺癌组织和癌旁组织中p-CHEK2Thr68染色均在细胞核中分布，未见细胞浆染色现象，乳腺癌组织中p-CHEK2Thr68染色强度相对高于癌旁组织。见图1（封四）。

以p-CHEK2Thr68定位于细胞核来评估表达情况，经二级计分法判定p-CHEK2Thr68在乳腺癌中的表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 p-CHEK2Thr68表达水平与乳腺癌临床病理参数的关系

p-CHEK2Thr68在无淋巴结转移组的表达率高于有淋巴结转移组，在ER阴性组高于ER阳性组，PR阴性组高于PR阳性组，HER2阴性组高于HER2阳性组，在三阴性乳腺癌中高于非三阴性乳腺癌，差异有统计学意义（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表达与患者的发病年龄、月经状态、组织分级、肿瘤大小、TNM分期、P53状态之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

CHEK2（chenkpoint kinase 2）基因位于染色体22q12.1，包含14个外显子，编码蛋白为543个氨基酸。激酶区位于靠近C端的功能区，很多与肿瘤相关并且影响CHEK2激酶活性的突变都位于该区[3]。在无细胞DNA损伤时，CHEK2通常以无活性的单体分布于细胞核中。当DNA发生损伤时，尤其是发生DNA双链断裂损伤时，毛细血管扩张性共济失调突变（ataxia telangiectasia mutation，ATM）基因激活，进而诱导CHEK2聚集到受损染色体，促进CHEK2激酶的Thr68、Thr383和Thr387等一些关键氨基酸残基的磷酸化[4-5]。

作为一种蛋白激酶，CHEK2的活化起始于Thr68位点的磷酸化，而后进一步激活T-Loop环上的Thr383和Thr387位点，启动CHEK2蛋白的自磷酸化过程，形成能够发挥生物学作用的二聚体[6]。Thr68磷酸化是CHEK2蛋白活化的重要始动环节，最能反映CHEK2激酶的活性[7]。Carlessi等[8]发现多种肿瘤组织中都存在著不同程度的p-CHEK2 Thr68位点的磷酸化，而在正常组织、增生组织和炎性组织中未能检测到相同现象。Oka[9]等也发现，p-CHEK2Thr68蛋白在晚期肠癌患者肿瘤组织中的表达高于正常组织和腺瘤组织。在本研究中，应用CST公司的Phospho-Chk2（Thr68、C13C1）抗体检测人大肠癌组织的p-CHEK2Thr68蛋白表达，该抗体被广泛应用于前列腺癌、口腔鳞癌、胰腺上皮内瘤变等组织的p-CHEK2Thr68蛋白组织学检测，具有可信的灵敏度和特异性[10-12]。本研究发现p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示肿瘤组织中存在CHEK2激酶Thr68位点的活化。

據文献报道，CHEK2基因多态性可能是食道癌淋巴结转移的保护性因素，但关于p-CHEK2Thr68在乳腺癌淋巴结转移中的作用尚不明确[13-14]。本研究发现，p-CHEK2Thr68阳性表达率在无淋巴结转移组显著高于有淋巴结转移组，提示其与乳腺癌淋巴结转移具有潜在的相关性。在临床上三阴性乳腺癌的无疾病生存时间和无进展生存时间都相对较短，复发转移性三阴性乳腺癌在治疗早期缓解后很容易出现疾病的再次进展[15]。本研究发现，三阴性乳腺癌中p-CHEK2Thr68蛋白水平明显高于非三阴性乳腺癌，提示CHEK2激酶活化和DNA损伤修复通路可能参与三阴性乳腺癌的疾病进展。有研究表明，靶向抑制CHEK2明显降低肿瘤细胞的DNA损伤修复功能，并且使肿瘤对化疗药物重新获得敏感，提示CHEK2和其调节的细胞DNA损伤修复通路与肿瘤化疗的耐受性密切相关[16]。Liang等[17]发现顺铂诱导的卵巢癌细胞CHEK2磷酸化依赖于野生型P53；在P53缺陷细胞，顺铂不能诱导CHEK2蛋白磷酸化。CHEK2抑制剂可提高顺铂对p53缺陷肿瘤细胞的疗效。因此有望通过CHEK2抑制剂的联合使用以实现铂类药物耐药的逆转。

相关研究发现乳腺癌患者中p-CHEK2Thr68蛋白阳性的患者较阴性患者总生存期短，提示CHEK2激酶的活化可能参与放、化疗耐受，p-CHEK2Thr68表达阳性的乳腺癌可能更易于发生放化疗耐药[18]。抑制CHEK2的功能可能会提高肿瘤治疗的反应性，逆转肿瘤耐药，改善预后[19]。近年来，针对细胞周期检查点的分子靶向药物临床试验已经在进行中，靶向抑制CHEK2激酶将有望成为乳腺癌治疗的新方向[20]。

综上所述，本研究发现，p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且与临床病理参数相关。提示采用免疫组化方法检测乳腺癌组织中p-CHEK2Thr68的表达情况以观察其生物学行为，将有助于制定乳腺癌患者的个体化治疗方案。

[参考文献]

[1] Li T，Mello-Thoms C，Brennan PC. Descriptive epidemiology of breast cancer in China：incidence，mortality，survival and prevalence [J]. Breast Cancer Res Treat，2016，159（3）：395-406.

[2] Apostolou P，Papasotiriou I. Current perspectives on CHEK2 mutations in breast cancer [J]. Breast Cancer（Dove Med Press），2017，9：331-335.

[3] Cai Z，Chehab NH，Pavletich NP. Structure and activation mechanism of the CHK2 DNA damage chekpoint kinase [J]. Mol Cell，2009，35（6）：818-829.

[4] Manic G，Obrist F，Sistigu A，et al. Trial Watch：Targeting ATM-CHK2 and ATR-CHK1 pathways for anticancer therapy [J]. Mol Cell Oncol，2015，2（4）：e1012976.

[5] Yan S，Sorrell M，Berman Z. Functional interplay between ATM/ATR-mediated DNA damage response and DNA repair pathways in oxidative stress [J]. Cell Mol Life Sci，2014，71（20）：3951-3967.

[6] Gabant G，Lorphelin A，Nozerand N，et al. Autophosphorylated residues involved in the regulation of human chk2 in vitro [J]. J Mol Biol，2008，380（3）：489-503.

[7] Zannini L，Delia D，Buscemi G. CHK2 kinase in the DNA damage response and beyond [J]. J Mol Cell Biol，2014，6（6）：442-457.

[8] Carlessi L，Buscemi G，Fontanella E，et al. A protein phosphatase feedback mechanism regulates the basal phosphorylation of Chk2 kinase in the absence of DNAdamage [J]. Biochim Biophys Acta，2010，1803（10）：1213-1223.

[9] Oka K，Tanaka T，Enoki T，et al. DNA damage signaling is actvated during cancer progression in human colorectal carcinoma [J]. Cancer Biol Ther，2010，9（3）：246-252.

[10] Fan C，Quan R，Feng X，et al. ATM activation is accompanied with earlier stages of prostate tumorigenesis [J]. Biochim Biophys Acta，2006，1763（10）：1090-1097.