蜜环菌发酵生产胞外漆酶的工艺优化

（天津天狮学院生物与食品工程学院，天津 301700）

蜜环菌（Amillariella mellea）是一种药食两用真菌，多作为药材天麻的伴生菌。工业化生产多采用液体深层发酵技术[1]，发酵液中富含多种活性成分，以蜜环菌液态发酵产物开发出的众多商品[2]。漆酶（EC 1.10.3.2）是蜜环菌发酵液中积累的一种绿色环保型多酚氧化酶，其活性中心含有金属离铜，可以催化酚类及芳胺类物质的聚合、降解及转化，近年来在在工业、农业、食品[3]、废水处理[4-5]和医药[6]等领域市场前景广阔[7]。

以深层液态发酵培养可以提高漆酶的产率，许多学者致力于研究漆酶生产的发酵条件。司静等[8]分别以麦芽糖和蛋白胨作为碳源和氮源，筛选出漆酶高产菌株为东方栓孔菌Trametes orientalis Cui. 6300，一定程度上缩短漆酶生产周期。徐雪霏等[9]对黄多孔菌发酵产漆酶的条件进行优化，提高酶活2.5倍，发现影响该菌产生漆酶的主要营养因素为碳氮比。实验证明漆酶发酵较适pH多集中在4.0～6.0，不同的真菌有它们各自的最佳pH，且底物不同，最适发酵pH也差异明显[10-12]。目前，漆酶的研究还在探索，很多方面需要完善，对漆酶发酵的研究暂时还主要在实验室中进行，产漆酶培养基的优化和大规模生产是将来发展的趋势，漆酶的价值会紧跟着科技时代的步伐，慢慢地被世人所熟知。

本研究利用实验室培养保存的蜜环菌进行发酵培养，改变培养条件，测定发酵液中漆酶的活性，对蜜环菌产漆酶的发酵工艺进行优化，旨在找出适宜大批生产的操作方案，为企业提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

蜜环菌A9，购于华中农业大学菌种实验中心，经天津天狮学院生物工程实验中心扩大培养用于试验。

1.1.2 试验试剂

葡萄糖、可溶性淀粉、2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（简称ABTS，Sigma-Alorich生产）等，购于上海蓝季科技发展有限公司；七水硫酸镁、氯化钙、氯化铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨等，购于天津市风船化学试剂科技有限公司；玉米粉、麦麸，购于农贸市场。

1.1.3 仪器设备

恒温培养摇床HNY-200B，天津欧诺产；台式高速离心机TG16K-II，长沙东旺产；赛多利斯天平BSA124S，德国产；高压蒸汽灭菌锅MJ-78A，上海施都凯产；紫外可见分光光度计UV1000，上海天美产；超净工作台SW-CJ-2G，苏州净化产。

1.2 试验方法

1.2.1 试验培养基的制备

将1 L去离子水倒入电磁炉中，分别加入80 g麦麸，200 g马铃薯小块，大火煮沸后温火煮20 min，8层纱布过滤，用去离子水补足溶液至1 L。分别添加1.5 g MgSO4·7H2O、2 g KH2PO4、0.1 g CaCl2，0.01 g 维生素B1，用氢氧化钠和柠檬酸调整培养液的pH至6.0作为基本培养基。

公式中Kjaccard和Ksorensen为科、属、种相似性系数，A、B分别为两地区植物科、属、种数，C为两地区共有植物科、属、种数。

根据研究目的不同，在基本培养基中添加不同葡萄糖和蛋白胨分别作为碳源和氮源，添加一定量的微量元素，微量元素溶液见表1。

表1 微量元素溶液成分表

1.2.2 液体菌种制备及接种培养

将蜜环菌斜面菌种接种到综合PDA平板上25 ℃黑暗培养活化14 d。在超净台下，用打孔器取长势一致的菌丝，接种于液体培养基中，25 ℃、180 r/min摇瓶培养7 d，收集菌丝体悬液作为液体菌种。接种时，在超净台下用取液器精确吸取2 mL加入到不同试验组，在25 ℃、180 r/min摇床中培养。

1.2.3 酶活力测定

摇床培养15 d后，取出一定量的发酵液，经5 000 r/min离心20 min后，取上清液测试酶活力[13-14]，酶活力单位定义为1 min转化1 μmol ABTS，使ABTS自由基浓度增加量。每个处理做3次重复取平均值作为酶活力。

1.2.4 单因素试验研究

（1）葡萄糖添加量对漆酶酶活的影响。在基础培养基中分别加入葡萄糖15、20、25、30 g和35 g，蛋白胨4 g，加入10 mL微量元素溶液，每个水平分别做3次重复，接种培养15 d后，测定酶活力，记录结果（下同）。

（3）初始pH对漆酶酶活的影响。在基本培养基中添加20 g葡萄糖，C/N为5，添加10 mL微量元素溶液pH为分别调节到5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，培养后测定并记录结果。

（4）微量元素添加量对漆酶酶活的影响 在基本培养基中添加20 g葡萄糖，C/N为5，溶液pH调节6.0，添加微量元素溶液量分别为5、10、15、20 mL和25 mL，培养后测定并记录结果。

1.2.5 正交试验研究

通过单因素优选的四个不同因素的三个水平，采用L9（34）正交实验设计，进一步确定因素的主次及发酵产漆酶的最佳工艺。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖添加量对漆酶酶活的影响

在基础培养基中分别按1.5%～3.5%的量添加葡萄糖，其他培养条件不变，研究葡萄糖的添加量对产漆酶的酶活的影响，发酵至15 d后取上清液进行测定酶活力，结果如图1所示。

图1 不同葡萄糖添加量对蜜环菌胞外漆酶酶活的影响图

由图1可见，葡萄糖添加量对发酵产漆酶的酶活力随着葡萄糖的增加，漆酶的酶活先升高后缓慢下降的趋势。当1 L培养基中添加2.5%葡萄糖时产漆酶量最多。继续增加含糖量可能对蜜环菌的生长产生部分抑制作用，分泌的胞外漆酶量略微下降。可见，在培养时过高的葡萄糖浓度既不经济，又不利于蜜环菌的生长。

2.2 不同碳氮比对漆酶酶活的影响

保持碳源氮源总量不变的前提下，以葡萄糖作为碳源，蛋白胨做氮源，设置5个不同水平的C/N，研究其对蜜环菌发酵产漆酶酶活的影响，结果如图2所示。

图2 不同碳氮比对蜜环菌胞外漆酶酶活的影响图

由图2可见，在碳氮源总量不变的前提下，随碳源增加，蜜环菌分泌的胞外漆酶酶活力呈现先增高后降低的趋势，反映出同葡萄糖效应同样的影响效果。当1 L培养基中添加22.5 g葡萄糖和7.5 g蛋白胨（即C/N=3）时产漆酶量最多。

2.3 不同初始pH对漆酶酶活的影响

调整配制完毕的培养基的pH在5～7共5个水平，分别测定发酵后的漆酶产量，结果如图3所示。

图3 不同初始pH对蜜环菌胞外漆酶酶活的影响图

由图3可见，发酵培养基初始pH维持在5～6时，蜜环菌生产的胞外漆酶活性较高。此范围的pH跟基本培养基配制完后的pH接近，在生产漆酶时，可以考虑不用调整pH，保持自然的pH即可。pH继续升高，漆酶产量明显降低，主要是由于较高pH对蜜环菌的生长有一定地抑制作用。

2.4 不同微量元素添加量对漆酶活力的影响

通过只改变微量元素的添加量，分别加入5～25 mL微量元素溶液，其他培养条件一致的情况下，培养完成后测定酶活力如图4所示。

图4 不同微量元素溶液添加量对蜜环菌胞外漆酶酶活的影响图

由图4可见，添加适量微量元素对蜜环菌发酵生产漆酶有益，可以促进菌体的生长，进而增加发酵液中漆酶的酶活。当1 L培养基中添加10 mL微量元素溶液时，发酵完成后漆酶活力达到峰值。加入过多的微量元素，漆酶的产量明显下降，可推断其对蜜环菌的生长存在抑制作用。

2.5 正交实验结果及分析

根据单因素的实验结果，从4个因素中各自选取3个水平进行L9（34）正交实验设计。因素水平表设计见表2，正交实验的结果见表3。

表2 因素水平表

由表3可知，影响蜜环菌发酵生产漆酶的因素主次顺序依次为葡萄糖添加量、C/N、微量元素添加量和初始pH。可见在培养基中的碳源对蜜环菌产漆酶影响较大，需要对添加碳源的种类进一步研究，确定最佳碳氮比以提高漆酶的生产效率。pH对产漆酶的影响相对较小，因而可以考虑配制基本培养基后，按照自然的pH进行发酵。

表3 正交实验的结果表

2.6 验证结果及分析

按照以上结果中最优方案，进行3次重复实验，测得1 L发酵液中漆酶活力为51202.0U，相对标准偏差小于5%。高于正交表格中实验数值，说明此工艺的优越性。

3 结论与讨论

确定蜜环菌发酵培养生产漆酶的最佳方案为添加葡萄糖2.5%，碳源氮源比为3，基本培养基中附加15 mL/L微量元素，pH5.0为最有利于漆酶的积累。可作为工业生产漆酶的参考方案。在实际生产过程中，由于pH的影响较小，可以直接利用配制完成的培养基进行发酵生产，无需调整pH。

发酵生产胞外漆酶的最适培养时间出现在14 d左右，此时酶活力最高，本次研究统一在15 d采集样品测定活力。比蜜环菌达到最大生长量的时间（10 d左右）有所滞后，说明当蜜环菌达到最大生长量后，胞外积累的漆酶数量才可达到峰值，从动力学角度分析，这种胞外漆酶的合成模型可能属于滞后合成型，需要进一步的研究确定，此时是分离纯化漆酶的最佳时间段。培养时间再长漆酶可能发生部分降解，影响产量。

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