儿童急性呼吸道感染病原学特征分析

于新芬 寇宇 周银燕 李钧 钱昕 杨旭辉 潘劲草

310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection, ARI)是儿童常见的感染性疾病，严重威胁儿童健康，给社会和家庭带来沉重的经济负担。2010年全球住院儿童中有1 190万为重症患者，300万为重症下呼吸道感染患者[1]。呼吸道病毒及肺炎衣原体、肺炎支原体是引起婴幼儿ARI的重要病原体。常见的呼吸道病毒包括：呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)1-4型、流感病毒A和B(Flu)、人鼻病毒(HRV)等。近年来新的病毒病原体也不断被报道，包括冠状病毒(NL63和HKU1)，人偏肺病毒(hMPV)、人博卡病毒(HboV)和Saffold心肌炎病毒(SAFV)。肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)也是引起幼儿ARI的重要病原体，过去由于对其认识不足和检测手段的限制，其感染状况被低估。随着新发现病原体数量的增多及临床实验室多重检测病原体能力的提高，常可在一个样本中检测到多个病原体，突出了合并感染在急性呼吸道感染中的潜在重要角色。呼吸道病原体合并感染的真正意义目前还是有争议的[2-4]。本研究对门诊和住院婴幼儿急性呼吸道感染病例中的病原谱进行了检测分析，旨在了解杭州地区病毒及肺炎支原体、衣原体的流行特征、合并感染特征，评估多重感染的临床意义，指导临床治疗、避免抗生素不合理使用，进而更好地做好疾病控制。

1 材料与方法

1.1样本来源收集2011年至2013年杭州地区0～10岁患儿急性呼吸道感染病例样本共908份,标本采集获患者知情同意。每周于杭州某儿童医院采集ARI住院病例样本共计652份，均为呼吸道吸出物。每周于该医院儿科门诊采集ARI病例样本共计256份，均为咽拭子；所有样本采集后送本中心实验室，于-80 ℃冰箱存放。

1.2核酸提取使用QIAgen DNA mini kit(51304)提取病原体DNA，使用 QIAgen RNeasy mini kit(74104)提取病毒RNA。实验操作步骤严格按说明进行。最后将核酸溶解于50 μl ddH2O中。

1.3逆转录及实时PCR检测使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210 A)进行反转录反应，反应体系为：1 μl 50 ng/ μl的6-per 随机引物，1 μl dNTP(10 mmol/L each)，8 μl提取的RNA，混匀置65 ℃ 5 min，冰上迅速冷却。再加入反应液：4 μl 5×PrimeScript II Buffer，0.5 μl Rnase Inhibitor(40 U/ μl), 1 μl PrimeScript II Rtase(200 U/μl)，ddH2O 4.5 μl。30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min进行反转录反应，70 ℃ 15 min灭活酶，置冰上冷却。cDNA保存于-30 ℃冰箱。

1.4常见呼吸道病毒及肺炎支原体和衣原体的筛检荧光定量PCR仪为ABI 7300。MP，CP的的检测使用上海之江试剂盒，检测按试剂盒说明书进行。病毒检测使用合成引物探针及Ex Taq酶(Takara，DRR001A)进行，引物探针序列参考文献[5-8]，由上海超世生物科技有限公司合成。

RNA病毒的检测：样本进行了RSV、HRV、FluA, FluB、SAFV、PIV1-4、HKU1，OC43，229E，NL63，hMPV的检测。取1 μl cDNA为模板，扩增使用EX Taq酶，反应体积为20 μl，含1×buffer、MgCl23 mmol/L、dNTPs各0.2 mmol/L、引物各0.4 μmol/L、探针各0.2 μmol/L、Ex Taq酶25 U/ml。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，45个循环。于60 ℃检测通道的荧光信号。

DNA病毒检测：样本进行了腺病毒(AdV)和博卡病毒(hBoV)的检测。取样本DNA2 μl为模板，扩增使用使用EX Taq酶，反应体系和条件同上。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0软件分析检测结果和临床数据。采用χ2检验比较不同组的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1人口学特征本研究共收集908份呼吸道感染病例样本，患者年龄分布从1个月至10岁。门诊病例与住院病例的比例是1∶2.55。256例门诊病例中，<1岁72例，1～<3岁94例，3～<6岁53例，6～≤10岁37例；男孩与女孩的比例是1.98∶1。652例住院病例中，<1岁475例，1～<3岁126例，3～<6岁27例，6～≤10岁24例；男女比例1.88∶ 1。

表1 儿童急性呼吸道感染不同年龄组病原的检出情况及两组病例病原检出率的比较

注：表内的χ2值和P值为门诊病例和住院病例两组病例病原检出率的统计分析结果

Note:χ2andPvalue in this table are the statistical analysis results between outpatients and inpatients

2.2病原体荧光PCR检出情况住院急性呼吸道感染病例样本中，呼吸道病毒及MP、CP的总检出率是76.7%(500/652)，而在门诊病例样本中，总的检出率是43.0%(110/256)，两者之间的差异具有统计学意义(χ2=94.79，P<0.001)。在门诊病例中，最常见的感染是AdV，阳性率为15.2%(39/256)，其次是Flu(11.7%)、PIV(7.8%)、hMPV(6.6%)。门诊和住院患儿各病原的检出情况详见表1。门诊病例中，检出的PIV以PIV-3型最多，占检出PIV的60%(12/20)。其次是PIV-1型，占35%(7/20)，仅检到1株PIV-4型，未检测到PIV-2型。在住院病例中，检出最多的也是PIV-3型，占91.4%(74/81)，其次是PIV-2(4.9%)型和PIV-1型(3.7%)，未检测到PIV-4型。本研究检出的冠状病毒95%为229E冠状病毒，其次为OC43冠状病毒，未检测到其他型别的冠状病毒。

本研究中，门诊病例中AdV的检出率高于Flu，但二者之间的差异没有统计学意义(χ2=1.357，P=0.198)。AdV和Flu在门诊病例中检出率较高，与住院病例的检出率的差异具有统计学意义(Flu,χ2=16.95，P<0.001；AdV,χ2=27.19，P<0.001)。RSV、HRV、SAFV、MP和CP均是在住院病例中感染率较高，与门诊病例组的检出率差异具有统计学意义(P<0.001)，χ2值分别为97.57、20.44、14.43、33.79、13.22。PIV和hBoV在住院病例组的检出率也是显著高于门诊病例组(P<0.05)，χ2值分别为3.95和9.49。而hMPV和CoV在两种病例检出率之间的差异没有统计学意义。

门诊和住院患儿不同年龄组病原的检出情况详见表1。住院病例中，随着儿童年龄增大，RSV的阳性率逐渐降低，<1 岁婴儿为40.4%，1～<3、3～<6、6～≤10岁组儿童则分别为21.4%、14.8%和8.3%；HRV在低年龄组(<1岁和～<3岁)阳性率较高(14.1%和19.8%)，而MP在高年龄组(3～<6岁和6～≤10岁)中阳性率较高(48.1%和37.5%)。门诊病例中，随着儿童年龄增大，流感病毒阳性率增高，4个年龄组阳性率分别为2.8%、6.4%、18.9%和32.4%。值得一提的是，两组病例≥2种病原的感染率均是在3～<6岁年龄组最高，分别为13.2%和40.7%。

2.3季节分布特征相对于门诊病例，住院病例病原的月分布更为多样，每月的病原组成更为丰富。RSV在住院病例中具有明显的季节特征，春季和冬季为高发季节；但RSV在门诊病例中的季节分布并不明显。PIV则在两种病例样本中均较常见，流行季节相似，住院病例和门诊病例中分别为4～9月份和6～8月份，均在夏季有一个流行高峰。AdV在门诊病例中的季节分布很明显，4～6月份为高发期，而在住院病例中的季节分布不明显。另有冠状病毒、鼻病毒、偏肺病毒、SAFV等病毒在住院病例和门诊病例中的季节分布均不明显，或许需要更大量样本来研究其季节分布特征。

2.4合并感染病原学特征本研究610例检测阳性的病例中，206例(22.7%)患儿标本中检测到2种或2种以上病原。其中门诊病例17例为合并感染，合并感染率为6.6%(17/256)；住院病例189例为合并感染，合并感染率为29.0%(189/652)，住院病例的合并感染率高于门诊病例，差异具有统计学意义(χ2=52.34，P<0.001)。门诊病例的合并感染中，二重感染16例，三重感染1例，未见四重及以上感染。二重感染中最常见的是hMPV+Flu(4/16)，其他二重感染均为1例或2例。住院病例的合并感染中，二重感染132例，三重感染43例， 四重感染12例，五重感染2例。二重感染中最常见的是RSV+hMPV(15/132)、RSV+SAFV(15/132)、RSV+HRV(14/132)和M+C(11/132)。三重感染中最常见的是RSV+M+C(5/43)、PIV+M+C(3/43)。二重和三重感染病原组合很多，其他组合例数较少，没有发现明显的规律性。而四重和五重感染的病原组合均不相同。

住院病例中，除RSV和Flu合并感染率分别为36.4%和50.0%，其他病毒合并感染的病例数均大于其单一感染病例数。门诊病例中，除冠状病毒和肺炎衣原体阳性病例数少，表现为单一感染例数大于等于合并感染例数外，其他病毒合并感染例数均小于其单一感染例数。各病毒在门诊病例中的感染以单一感染为主，在住院病例中以合并感染为主。其中AdV在两组病例中的感染差异具有统计学意义(χ2=18.90，p<0.001)。详见表2。

2.5急性呼吸道感染住院病例临床及感染特征分析本研究652例婴幼儿急性呼吸道感染住院病例中，收集到647例病例的临床资料。住院病例最常见的症状是发热(56.9%)、咳嗽(98.0%)、气短或呼吸困难(36.6%)、X射线显示肺部异常(81.9%)、肺部听诊异常(87.0%)等。肺部听诊异常主要表现为湿罗音、痰鸣音、哮鸣音。最常见的并发症是肺炎(88.6%)和呼吸衰竭(4.2%)。最常见的基础疾病是先天性心脏病(10.8%)和哮喘(3.4%)。

本研究对病毒及MP、CP单一感染和多重感染病例的的临床特征进行了统计分析，没有发现其临床症状的显著性差异，也没有发现多重感染与并发症及基础疾病有显著相关性。将病毒及MP、CP感染病例与未检出病例进行了临床特征的比较，发现病毒或MP、CP感染病例X射线肺部异常较未检出病例高，差异具有统计学意义(χ2=3.92，P<0.05)。病毒或MP、CP感染病例发生肺炎的比例较未检出病例高，差异具有统计学意义(χ2=10.76，P<0.001)。详见表3。

3 讨论

ARI迄今仍是中国首位感染性疾病，也是抗生素使用频率最高、数量最大、合理性亟待提高的疾病[9]。明确病原是合理用药的基础。中国幅员辽阔，各地ARI的病原体构成有所不同，建立不同地域、不同人群ARI病原谱及感染特征，对推动临床ARI合理、安全及有效用药有着积极意义。本研究表明，杭州地区ARI病例中，病毒依然是最常见的病原，这与国内外的报道基本一致[10-12]。本研究将病毒及MP、CP感染住院病例与未检出住院病例进行了临床特征的比较，发现病毒、MP、CP感染病例X射线肺部异常较未检出病例高，发生肺炎的比例也较未检出病例高，差异均有统计学意义。这说明病毒及MP、CP是引起急性呼吸道感染住院病例X射线肺部异常和肺炎的主要病原，病毒及MP、CP未检出病例感染的可能是细菌或其它未检测的病毒，进一步突出了病毒及MP、CP在急性下呼吸道感染中的重要地位。

表2 门诊病例和住院病例中各病原的合并感染率比较

备注：a.合并感染率为合并感染例数/总感染例数，b.为Fisher精确检验

Note: a: co-infection rate in this table means the total infection cases divided by co-infection cases.b: Fisher exact test

表3 急性呼吸道感染住院病例临床及感染特征分析

杭州地区引起ARI住院病例的最重要病原体是RSV，其次为MP、HRV、PIV等。而门诊病例中，最常发的病毒为AdV、Flu和PIV。这与刘春艳等[11]报道的北京住院和门诊病例的感染情况基本一致。本研究中，除hMPV和CoV外，其他病原(RSV、PIV、HRV、Flu、hBoV、AdV、SAFV及MP、CP)在两组病例间检出率的差异均有统计学意义。表明不同病例种类之间的病原谱差异是很大的，且住院病例的病原谱更为复杂多样，这可为ARI的防治及用药提供一定的指导。本研究门诊病例中AdV的检出率(15.2%)略高于Flu(11.7%)，这可能与流感当年流行情况有关，但仍然说明在门诊病例中AdV有着较高的感染率。本研究中AdV在门诊病例中的感染浓度较高，而在住院病例中通常浓度较低，多为伴随感染，且AdV在两组病例中的合并感染率差异具有统计学意义，更突出了AdV在门诊病例中的重要地位。另外许晶等[13]对流感样病例中腺病毒的检出率和冯录召等[14]、季伟等[15]对住院病例RSV和MP的检出率，与本研究略有不同，这可能是因为病原流行的地域差异、样本种类以及检测方法不同。如本研究使用PCR方法检测MP，而季伟等采用了PCR和ELISA联合的方法进行检测。

近年来，科研人员不断发现更多与呼吸道感染相关的病毒，如SAFV。SAFV是近年来从人体分离到的一种新的心病毒，至今已发现11种基因型[16]。SAFV除了经粪一口途径感染，还能通过呼吸道传播，但相关报告甚少，且其流行病学和临床意义尚不明了。因此，本研究对杭州地区急性呼吸道感染标本进行了SAFV病毒检测，SAFV在住院病例中的阳性率为9.8%，与周琼华等[17]报道的长沙地区的10.4%相近。本研究中SAFV在门诊病例中的阳性率为2.34%，与住院病例相比，差异具有统计学意义(P<0.001)。表明SAFV主要存在于住院病例的急性下呼吸道感染中。推测SAFV病毒感染可能与患儿下呼吸道感染的病程相关。

呼吸道病毒感染力强，传播速度快，易造成局部流行。Ramaekers等[18]研究表明儿童较成人更容易获得合并感染。Achten等[19]研究发现，病毒的合并感染存在干扰现象，如RSV感染儿童中，HRV的感染率明显偏低。呼吸道常见病毒间的合并感染率一般为0.6%～27%，冬季时可高达35%。Wishaupt等[20]报道儿童ARI的合并感染率为22.5%。本研究中，住院病例合并感染率为29.0%，门诊病例合并感染率为6.6%。刘春艳等[11]报道住院患儿合并感染率(30.1%)高于门诊患儿(6.8%)，与本研究一致。合并感染在住院病例样本中存在非常普遍，合并感染率可能主要与病例类型和样本类型有关。本研究189例住院病例合并感染中，各病原体之间的合并感染组合很多，错综复杂，没有发现明显的规律性。本研究儿童ARI中病毒单一与合并感染的临床症状之间没有显著性差异，与Wishaupt等[20]报道基本一致。

目前对合并感染和疾病严重程度的相关性的了解还是有限的。检测到的病毒不一定就是主要致病原，还可能代表无症状存在、潜伏期等情况。一些研究表明多病原合并感染可以增加疾病的严重程度[2-3,21]，而另一些研究却得出相反的结论[4]。这或许与采样人群、临床情况、病毒的流行季节性甚至与细菌的合并感染等有关。本研究没有发现多重感染与并发症及基础疾病有显著相关性，但住院病例中的合并感染率明显较高，与门诊病例的合并感染率差异有统计学意义，提示合并感染和疾病的严重程度有一定关系。

利益冲突:无

参考文献

[1] Nair H, Nokes DJ, Gessner BD, et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet, 2010, 375(9725):1545-1555. DOI: 10.1016/S0140-6736(10)60206-1.

[2] Harada Y, Kinoshita F, Yoshida LM, et al. Does respiratory virus coinfection increases the clinical severity of acute respiratory infection among children infected with respiratory syncytial virus[J]. Pediatr Infect Dis J, 2013,32(5): 441-445. DOI:10.1097/INF.0b013e31828ba08c.

[3] Franz A, Adams O, Willems R, et al. Correlation of viral load of respiratory pathogens and co-infections with disease severity in children hospitalized for lower respiratory tract infection[J]. J Clin Virol, 2010, 48(4):239-245. DOI: 10.1016/j.jcv.2010.05.007.

[4] Asner SA, Rose W, Petrich A, et al. Is virus coinfection a predictor of severity in children with viral respiratory infections[J]. Clin Microbiol Infect, 2015, 21(3):261-264. DOI:10.1016/j.cmi.2014.08.024.

[5] Raymond F, Carbonneau J, Boucher N, et al. Comparison of automated microarray detection with real-time PCR assays for detection of respiratory viruses in specimens obtained from children[J]. J Clin Microbiol,2009,47(3): 743-50.

[6] 于新芬，潘劲草，寇宇等. 婴幼儿疑似甲型H1N1重症病例及门诊流感样病例中鼻病毒的检测分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2012, 28(3): 278-283. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2012.03.020.

[7] Drexler JF, Luna LK, Stöcker A, et al. Circulation of 3 lineages of a novel Saffold cardiovirus in humans. Emerg Infect Dis[J], 2008,14(9): 1398-405.

[8] Kantola K, Sadeghi M, Antikainen J, et al. Real-time quantitative PCR detection of four human bocaviruses[J]. J Clin Microbiol,2010, 48(11): 4044-4050.

[9] 季伟，陈慧中. 亟待提高对急性呼吸道感染多病原学联合检测重要性的认识[J]. 中华预防医学杂志, 2011,45(3): 197-199. DOI: 10.3760/ema.j.issn.0253-9624.201 1.03.002.

[10] 邹丽容, 周杰, 李晖,等. 2006—2009年广州急性呼吸道感染患者病毒病原学调查[J]. 中华预防医学杂志， 2011,45(9): 825-829.

[11] 刘春艳，肖艳，谢正德等. 2010至201 2年门诊和住院儿童急性呼吸道感染病毒病原比较分析[J]. 中华儿科杂志, 2013, 51(4): 255-259. DOI: 10.3760/cina.I.issn.0578-1310.2013.04.004.

[12] Bhuyan GS, Hossain MA, Sarker SK, et al. Bacterial and viral pathogen spectra of acute respiratory infections in under-5 children in hospital settings in Dhaka city[J]. PLoS One， 2017, 12(3): e0174488.

[13] 许晶, 岳姝婷, 马萍，等. 西安市流感样病例中人腺病毒感染特点分析[J]. 中华实验和临床病毒学杂志， 2017， 31(3): 218-222. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.08.

[14] 冯录召, 赖圣杰, 李夫等. 2009—2012年我国6省(市)5岁以下儿童住院肺炎病例的病毒病原学分析. 中华流行病学杂志， 2014， (6): 646-649.

[15] 季伟，陈正荣，周卫芳等. 2005—2011年苏州地区急性呼吸道感染住院儿童病原学研究[J]. 中华预防医学杂志, 2013, 47(6):497-503. DOI: 10.3760/ema.issn.0253-9624.2013.06.005.

[16] 马亦林. Saffold心病毒对人类感染的研究进展[J]. 中华临床感染病杂志，2014, 7(5): 476-480. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2014.05.022.

[17] 周琼华，张兵，谢志萍等. 长沙地区呼吸道感染儿童Saffold心肌炎病毒的调查[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2011, 25(1): 8-10. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2011.01.004.

[18] Ramaekers K, Keyaerts E, Rector A, et al. Prevalence and seasonality of six respiratory viruses during five consecutive epidemic seasons in Belgium[J]. J Clin Virol, 2017, 94:72-78. DOI: 10.1016/j.jcv.2017.07.011.

[19] Achten NB, Wu P, Bont L, et al. Interference between respiratory syncytial virus and human rhinovirus infection in infancy[J]. J infect dis, 2017, 215(7): 1102-1106. DOI: 10.1093/infdis/jix031. DOI: 10.1093/infdis/jix031.

[20] Wishaupt JO, van der Ploeg T, de Groot R, et al. Single- and multiple viral respiratory infections in children: disease and management cannot be related to a specific pathogen[J]. BMC Infect Dis, 2017, 17(1): 62. doi: 10.1186/s12879-016-2118-6.

[21] Garcia-Garcia ML, Calvo C, Ruiz S, et al. Role of viral coinfections in asthma development[J]. PLoS One， 2017, 12(12): e0189083. DOI: 10.1371/journal.pone.0189083.