克拉霉素微生物限度检查方法学验证

胡小锋

天津红日药业股份有限公司 天津 301700

克拉霉素在临床上主要用于抗感染治疗，属于大环内酯类抗生素，对部分革兰阴性菌，革兰阳性菌及支原体的感染有很强的治疗作用。在2015年版《中国药典》中记载，1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法用于检查非无菌制剂及其原辅料等是否符合相应的微生物限度标准。本文采用五种阳性对照菌，对其回收率进行测定，用微生物限度检查方法学对克拉霉素进行试验[1]。

1 试验材料和仪器

（1）供 试 样 品：克 拉 霉 素，批 号：Y00601170401G、Y00601170402G、Y00601170403G，厂家：宁夏启元药业有限公司。

（2）培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：20151012，厂家：青岛日水生物技术有限公司；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：20150215，厂家：青岛日水生物技术有限公司；胰酪大豆胨液体培养基，批号：VM679659509，厂家：默克密理博；沙氏葡萄糖液体培养基，批号：20150215，厂家：青岛日水生物技术有限公司；pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，批号：VM680982514，厂家：默克密理博；0.9%无菌氯化钠溶液：批号：1609281601，厂家：石家庄四药有限公司。

（3）试验菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

（4）仪器：鑫贝西生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X；永生生化培养箱SHH-500L。

2 计数需氧菌、霉菌及酵母菌的验证方法

克拉霉素为抗生素类药物，具有较强的抑菌活性，在2015年版《中国药典》中记载，随非无菌产品1105进行微生物限度测试，本品采用薄膜过滤法进行试验。

2.1 菌液制备

将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物倒入胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养18-24h；把白色念珠菌的新鲜培养物转移到沙氏葡萄糖液体培养基中，23℃培养2-3d。用0.9%无菌氯化钠溶液制成的菌悬液可以得到上述培养物。用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基接种黑曲霉的新鲜培养物[2]，经23℃培养5-7d，加入3-5mL的含0.05%（mL/mL）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱，然后用无菌试管吸出孢子悬液，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。各试验菌的接种量不大于100cfu。

2.2 供试液的制备

取10g试验样品，加入pH7.0的蛋白胨氯化钠缓冲液至100ml，制成10-1供试液。取10-1供试液10ml，加入pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液至100ml，制成10-2供试液，取10-1供试液10ml，加入pH7.0白胨缓氯化钠缓冲液至100ml，制成10-3供试液。

2.3 薄膜过滤法（常规方法）

（1）试验组：取10ml供试品10-2，分别加入各试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml。

（2）菌液组：以稀释剂代替供试液，加入各试验菌进行试验组操作。

（3）供试品组：取10-2供试品10ml，用稀释剂代替菌液进行试验组操作。

（4）试验菌回收率的计算：回收率=[（试验组菌落数-供试品组菌落数）/菌液组菌落数]×100%。

（5）结果判断：试验菌回收率均在50%以上，这与验证测试相对应，可按照此方法进行需氧菌、霉菌和酵母菌的微生物计数，若试验菌回收率低于50%，应排除供试品的抑菌性，并重新找方法进行试验。

（6）克拉霉素通过薄膜过滤法，需氧菌总数检查试验菌回收率结果，见表1；霉菌和酵母菌总数检查试验菌回收率结果，见表2。

表1 需氧菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法）

表2 霉菌和酵母菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法）

由表2所示，白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率50%以上，此方法适用于霉菌和酵母菌计数，但是由表1可以看出，虽然白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率50%以上，而金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的回收率为0%。由此可见，克拉霉素对细菌的抑制性很强，排除供试品的抑菌活性必须重新找方法进行试验。

2.4 薄膜过滤法（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量）

（1）试验组：取10ml供试品10-3，加入试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，采用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，每次用量为100ml，总冲洗量分别是300ml、500ml、800ml。

（2）菌液组、供试品对照组均同法操作。

（3）克拉霉素薄膜过滤法（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量），细菌试验菌回收率结果，见表3。

表3 细菌试验菌回收率（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量）

由表3所示，采用最高的稀释级别10-3供试液10ml进行薄膜过滤，冲洗量为300ml，铜绿假单胞菌的回收率在50%以上；而总冲洗量为800ml时，金黄色葡萄球菌回收率仅为20.6%，枯草芽孢杆菌的回收率为40.5%，仍低于50%，需要重新建立方法进行验证。由此可见，克拉霉素对细菌抑菌作用强，特别是对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。

2.5 薄膜过滤法（采用均质袋）

（1）供试液的制备：取供试品10g，加入pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液100ml，并置含滤网的均质袋中，并使其均匀分散，制成10-1供试液。取10-1供试液10ml，加入pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液100ml，制成10-2供试液。依上述方法制成10-3供试液。

（2）试验组：取10-3供试品10ml，加入500mlpH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，再分别加入试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml。

（3）菌液组、供试品对照组均同法操作。

（4）克拉霉素通过薄膜过滤法（采用均质袋），需氧菌总数检查方法试验菌回收率结果，见表4。

表4 需氧菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法采用均质袋）

由表4所示，采用均质袋，利用薄膜过滤法，进行试验后各菌的回收率都在50%以上，证明这种方法可以排除供试品的抑菌性，因此可采用均质袋并通过薄膜过滤法进行克拉霉素的需氧菌计数。

3 控制菌检查方法的验证

（1）供试液的制备：取10g供试品，加入pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液100ml，并置含滤网的均质袋中，使分散均匀，制成10-1供试液。

（2）试验组：取10ml供试品10-1，加入500mlpH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，再加入大肠埃希菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml，抽滤，取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基,33℃培养18-24小时，依法检查。

（2）阳性对照组：取不超过100cfu大肠埃希菌至400ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。

（3）阴性对照组：以稀释剂代替供试液照相应的控制菌检查法检查。

（4）试验结果：试验组、阳性对照组检出大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。

4 结果

根据上述试验结果，克拉霉素的微生物限度检查采用下列方法，取10g供试品，加入pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液到100ml，并置含滤网的均质袋中，使分散均匀，制成10-1供试液，依次制成10-2、10-3供试液，需氧菌总数：取10ml供试品10-3，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml；霉菌和酵母菌总数：取10ml供试品10-2，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml；控制菌检查：取10ml供试品10-1，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml，取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基，依法检查大肠埃希菌。

5 讨论

有很多因素直接影响微生物的生长，特别是对药品微生物的污染。一些药物自身具有抑菌作用，因此利用微生物限度检查方法对其进行试验时，应考虑采用适合的方法排除对供试品的抑菌性。克拉霉素对细菌的抑菌作用很强，本文试验供试品制备时，采用含滤网的均质袋，使药品分散均匀，吸取供试液加入到稀释剂中，再进行薄膜过滤，并冲洗，联合作用下去除了克拉霉素的抑菌活性，提高了克拉霉素微生物污染菌的检出。