抑制P- 糖蛋白转运体功能在逆转肿瘤多药耐药中的研究现状及进展

李甲，陈宝安

(东南大学附属中大医院 血液内科，江苏 南京 210009)

肿瘤因其高发病率及死亡率严重影响着人类的健康，在其所有的治疗手段中，化疗是其中一种主要的治疗手段。随着医学及科学技术的不断发展，越来越多的化疗药物被不断研制及开发，但不幸的是，在治疗过程中肿瘤会对化疗药物逐渐产生耐药性[1]。多药耐药(multidrug resistance)定义为对多种具有不同结构及药动力学作用的药物产生交叉耐药性[2]，从而影响药物疗效及患者预后[3]。

涉及肿瘤多药耐药作用的其中一个重要机制[4]即为P- 糖蛋白(P- glycoprotein)的过表达。P- 糖蛋白属于ATP结合盒(ATP- binding cassette)转运载体蛋白家族中一员，ATP结合盒转运载体蛋白具有一个共同的膜内结合域，它被叫做核苷酸结合域，这个结构域可以整合并利用水解ATP的能量主动从细胞内将药物泵出至胞外从而降低细胞内药物浓度[5- 6](图1)。在所有的ABC膜转运蛋白家族中，P- 糖蛋白(ABCB1)、多药耐药相关蛋白(ABCC1)和乳腺癌耐药蛋白(BRCP/ABCG2)是与肿瘤多药耐药作用联系最为紧密的。

TMD.跨膜结合域；NBD.核苷酸结合域

图1P-糖蛋白结构示意图

1 P- 糖蛋白在肿瘤多药耐药中的作用

P- 糖蛋白是一种由1 280个氨基酸组成、大小约为170 kDa的跨膜糖蛋白并首次在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中被发现[7]，它是由位于第7号染色体上的MDR1基因编码[8]。这种糖蛋白包括两个跨膜结合域(transmembrane domain)及两个核苷酸结合域(nucleotide- binding domain)[9]，它由两个相似的部分组成，其中每一部分包含6个转运膜区和一个ATP结合利用区[10]。跨膜结合域与药物转运有关，而ATP结合利用区则是与ATP结合从而为转运药物提供能量。据我们所知，一旦药物与P- 糖蛋白结合，这些药物可诱导P- 糖蛋白结合ATP并发生巨大的构象变化，从而使其呈现出一个面向胞外的内腔并将药物从胞内泵出[11]。值得我们注意的是，核苷酸结合域的二聚化、药物与P- 糖蛋白的结合能力及ATP分子的合理利用程度是影响P- 糖蛋白功能充分发挥的三大重要影响因素[12]。P- 糖蛋白主要存在于上皮细胞上，包括结肠、小肠、胰腺、肾近端小管上皮及肾上腺上皮顶端部分等[13]，同时，它也被发现存在于血脑屏障内皮细胞上。作为一种能量依赖性“药泵”，它可将细胞内有毒物质泵出胞外从而保护细胞免受伤害[14]。与此同时，研究者发现在肾细胞癌、结肠癌、肝细胞癌和胰腺细胞癌等肿瘤中可见P- 糖蛋白的过表达；同时，像乳腺癌及神经母细胞瘤等肿瘤中P- 糖蛋白的表达无明显增加；然而，另一些肿瘤如卵巢癌、肺癌等检测出P- 糖蛋白低水平表达，这些肿瘤可能存在着除P- 糖蛋白介导的多药耐药以外的其他机制进而影响治疗效果[15]。并且，研究者还发现P- 糖蛋白具有抑制凋亡的作用，但其具体机制尚不明确。到目前为止许多相关理论已被提出，如干扰死亡诱导信号复合体(death- inducing signaling complex, DISC)和抑制caspase- 8激活等。此外，也有研究者提出P- 糖蛋白通过调节细胞内影响细胞凋亡通路的相关脂质因子水平如鞘脂类及其代谢产物，尤其是神经酰胺及1- 磷酸鞘氨醇，从而防止细胞凋亡发生[16]。

2 P- 糖蛋白抑制剂逆转肿瘤多药耐药

迄今为止，许多具有抑制P- 糖蛋白功能的药物已被相继研发出来[17]。通常来说，我们将P- 糖蛋白抑制剂分为3代[18]，第1代抑制剂代表药物如维拉帕米、环孢素A和他莫昔芬等，这些药物均为P- 糖蛋白作用底物。然而，为了达到有效血清药物浓度，它们的毒性作用会大大增加从而限制其临床应用[19]。第2代P- 糖蛋白抑制剂，如biricodar和valspodar等，这些药物参与细胞色素P450同工酶代谢过程并影响化疗药物在体内的正常代谢，从而导致严重的毒性[20]。然而，第3代抑制剂如tariquidar和zosuquidar等药物并不影响CYP3A4代谢同时可逆转肿瘤多药耐药作用，但同样的，之所以限制推广应用于临床还是因为不可避免的毒性作用[21]。

到目前为止，P- 糖蛋白作为一类“药物泵”将药物泵出胞外的具体机制尚不清楚，一些相关假设及理论已被提出。最先被提出的理论中假设P- 糖蛋白作为一类细胞膜上孔状结构[22]，将细胞内药物通过此通道泵出至胞外，随后的一些研究发现P- 糖蛋白作用机制类似翻转酶(flippase)[23]。然而，最被大众广泛认可的理论阐述了P- 糖蛋白作用方式类比“真空吸尘器”作用方式，它可将胞内药物通过其疏水中心排出至胞外[24]。

综合上述关于3代P- 糖蛋白抑制剂面临的相关问题，一种针对逆转肿瘤化疗多药耐药作用的有效并安全的P- 糖蛋白抑制剂亟待被发现。

3 逆转P- 糖蛋白介导的肿瘤多药耐药机制相关策略

考虑到P- 糖蛋白过表达是引起肿瘤多药耐药的一个重要原因，因此抑制P- 糖蛋白的表达及功能是克服肿瘤多药耐药作用最为直接的一种方法。除了上面谈到的3代P- 糖蛋白抑制剂以外，一般来说有以下3种作用机制抑制P- 糖蛋白功能：(1) 通过竞争性、非竞争性及变构调节抑制药物结合位点，从而增加胞内药物浓度；(2) 干扰ATP水解作用；(3) 改变细胞膜脂质构成完整性[25]。

大多数P- 糖蛋白调节剂是通过竞争性或非竞争性抑制药物结合位点进一步达到抑制P- 糖蛋白功能。在体外研究中证实P- 糖蛋白介导的底物运输可被饱和并对渗透压的变化敏感，而其底物浓度阶梯的维持又依赖于ATP水解作用。许多P- 糖蛋白抑制剂直接竞争性与位于蛋白上的药物结合位点结合从而减少具有细胞毒作用的药物被泵出，提高胞内药物浓度，进一步逆转肿瘤多药耐药作用。有研究人员证实了续随二萜酯(epoxylathyrol)衍生物在人结肠腺癌和小鼠T细胞淋巴瘤细胞中可逆转P- 糖蛋白介导的多药耐药作用。文章指出，通过功能学及化学敏感性分析均证实了所研究的23种衍生物针对人直肠腺癌和人ABCB1基因转染的L5178Y小鼠淋巴瘤细胞均具有逆转多药耐药的潜能。在这个实验中，研究者还通过ATPase酶活力分析进一步证明了这些衍生物在较高浓度水平下可抑制P- 糖蛋白运输底物维拉帕米，也从侧面验证了这些衍生物可通过P- 糖蛋白被缓慢地运输，进而降低其他底物如维拉帕米的运输效率，同时，研究者还发现了其中一种续随二萜酯衍生物epoxyboetirane R在其高浓度下可呈现一种非竞争性抑制现象，它可以同时抑制受激与基线的对钒酸盐敏感的ATPase活力。这个现象也暗示了可能存在变构效应，此衍生物本身对P- 糖蛋白变构位置具有较低的亲和力，但当它维持到一个较高浓度时则可引起对ATP水解具有重要影响的分子内运动，从而引起变构效应[26]。Kim等[27]通过实验证实了槲皮素- 7- O- 多聚甲醛偶合物(quercetin- 7- O- POM conjugates, 7- O- POM- Q)针对来源于药物敏感的人子宫肉瘤细胞(MES- SA)相对应的耐药细胞株MES- SA/Dx5具有显著的逆转多药耐药作用。通过ATPase活力及Rh123染色分析表明7- O- POM- Q可竞争性结合在P- 糖蛋白上的维拉帕米的药物结合位点，从而减少经P- 糖蛋白介导的相关药物泵出至胞外，同时，7- O- POM- Q与槲皮素相比，前者具有更缓慢的水解过程，相对稳定。

除此以外，还有一些调节剂具有刺激P- 糖蛋白上ATPase活力的功能从而抑制其“药物泵”的功能发挥。有研究人员发现NVP- TAE684针对人骨肉瘤细胞具有逆转多药耐药的作用，这项实验证实了NVP- TAE684作为一种激酶抑制剂同时也是一种有效的多药耐药逆转剂。它本身不属于P- 糖蛋白底物竞争性抑制剂，而是通过刺激ATPase活性进而抑制P- 糖蛋白功能，蛋白激酶常常通过抑制P- 糖蛋白功能或增强化疗药物诱导细胞凋亡作用逆转耐药。此实验也证实了NVP- TAE684对化疗常用药物如阿霉素、紫杉醇和ET- 743等均有逆转耐药作用[28]。同样地，Wang等[29]证实了西妥昔单抗——一种EGFR单克隆抗体，能以浓度依赖的方式激活P- 糖蛋白上ATPase活性，从而抑制了P- 糖蛋白介导的多药耐药作用。有趣的是，在实验中还发现了西妥昔单抗可减低细胞的流动性进而抑制P- 糖蛋白功能。

除了直接抑制P- 糖蛋白功能外，其他一些可选的方法已逐渐应用于实验研究中试图逆转多药耐药作用，提高化疗疗效。许多研究者应用基因沉默的方式去调节P- 糖蛋白表达水平。反义寡核苷酸(antisense ODNs)是一类可特异地与靶基因DNA或mRNA互补结合而抑制该基因表达的短序列DNA分子[30]。例如，Motomura等[31]研究发现在急性髓系白血病细胞和K562- ADR细胞系中加入反义寡核苷酸序列可直接影响MDR1 mRNA的表达水平，实验数据显示P- 糖蛋白功能被抑制，耐药细胞株重新对化疗药物柔红霉素反应敏感。然而截至到目前，尚无一种MDR1相关的反义寡核苷酸应用于临床治疗中。对于反义寡核苷酸来说，其本身存在诸多缺点进而降低了它的临床应用价值，如其毒性、不可避免的免疫原性及针对核酶的不稳定性等[32]。与此同时，我们也应该注意到反义寡核苷酸序列介导的P- 糖蛋白表达水平的降低是非特异性的，也就是说正常细胞的P- 糖蛋白表达水平也会受到影响，如表达在血脑屏障内皮细胞上的P- 糖蛋白，其作用是保护脑组织避免受到有毒物质的伤害，若降低了血脑屏障内皮细胞上的P- 糖蛋白表达水平，我们有理由认为脑组织可能会更容易受到外界不良因素的影响。

RNA干扰(RNA interference)技术是指由双链RNA分子(double- stranded RNA)诱发的、同源mRNA特异性识别及高效降解从而下调特定靶基因表达水平的过程[33]。这项技术往往依赖2种RNA分子：小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)、小发卡RNA(small hairpin RNA)。Wu等[34]利用纳米胶束共运输P- 糖蛋白相关siRNA与多柔比星药物致多柔比星耐药乳腺癌细胞株(MCF- 7/ADR)，可发现多柔比星IC50及P- 糖蛋白表达显著降低。RNA干扰技术同反义寡核苷酸序列一样，具有相似的缺陷。然而，许多研究者利用脂质体或纳米胶束等技术试图克服这些不足。Zhang等[35]通过体内实验证实了多柔比星- 小干扰RNA分子- 胶束复合体(Dox- siRNA- micelle)通过下调P- 糖蛋白水平进而显著抑制了HepG2/ADR肿瘤细胞的生长。这个复合体可以避免药物“药物泵”转运体的作用、提高胞内化疗药物浓度，并同时下调P- 糖蛋白表达水平。

核酶是一类具有催化作用的RNA分子，它可特异性识别mRNA中GUC序列从而剪切底物RNA分子，阻断靶基因的表达[36]。同时，其本身的可重复利用性、特异性、高效率及副作用少促使它成为一种新兴的逆转P- 糖蛋白介导的肿瘤多药耐药的治疗手段。许多相关研究表明应用针对MDR1表达的核酶可显著下调MDR1表达水平，从而使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性[37]。

另一个拥有广阔治疗前景的手段则是试图在转录水平下调MDR1过表达。相关研究表明，MDR1基因的表达受到与启动子结合的多个转录因子的共同调控[38]。Chen等[39]发现达沙替尼可以通过抑制ERK信号通路的激活从而在转录及翻译水平下抑制P- 糖蛋白的过表达现象，进一步逆转MCF- 7乳腺癌细胞株对多柔比星的耐药性。

值得我们注意的是，P- 糖蛋白的表达不仅仅位于胞浆内膜，它也可以存在于各种细胞器上，如溶酶体。Jansson等[40]通过实验发现了Dp44mT可作为一种新的抗肿瘤药物，并利用细胞内溶酶体上的P- 糖蛋白功能提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。此实验证实了Dp44mT是P- 糖蛋白的运输底物，并且逆转多药耐药作用依赖于Dp44mT- 铜复合体的氧化还原反应，此作用机制与上述所谈到的化疗药物作为常规P- 糖蛋白底物作用原理完全不同。因此，这也为我们寻找克服肿瘤多药耐药的手段提供了新的方向。

许多研究表明，P- 糖蛋白上ATPase活力也很大程度上受到细胞膜脂质组成变化的影响[41]。随后的一些研究也陆续发现根据P- 糖蛋白位于细胞膜的位置不同及膜脂质组成成分差异，其基底ATPase活力也随之变化。所以，我们有理由假设改变细胞浆膜生物化学、生物物理等特性从而调节P- 糖蛋白功能。

正如我们所知，许多中药也具有抗肿瘤作用，这些药物往往具有复杂的成分及作用机制，如直接杀伤肿瘤细胞、免疫调节等作用。相关研究者也认为中药作为逆转肿瘤耐药作用的调节剂具有较好的治疗前景，但目前注意力主要集中在探究中药单体的作用机制及治疗效果。

4 结 语

我们已经知道众多因素均可引起肿瘤多药耐药现象的发生，其中一个主要原因即为P- 糖蛋白的过度表达。P- 糖蛋白分布于许多组织细胞中，不可否认的是，P- 糖蛋白在药物吸收、分布、代谢及排泄方面发挥着重要功能，若只是一味地抑制P- 糖蛋白的功能则可能影响机体正常的生理功能[42]。目前尚无一种药物应用于临床针对肿瘤耐药的相关治疗，寻求一种靶向特异性高、副作用少的逆转剂对我们来说仍是一项艰难的挑战。我们在利用现有的治疗手段及方法克服肿瘤多药耐药现象的同时，更重要的是研究者们需深入探讨肿瘤多药耐药现象发生的分子病理学机制，这样才能促使我们更好、更科学地进行临床治疗。

[参考文献]

[1] FORD J M,HALT W N.Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer[J].Pharmacol Rev,1990,42(3):155- 199.

[2] CHIN K V,PASTAN I,GOTTESMAN M M.Function and regulation of the human multidrug resistance gene[J].Adv Cancer Res,1993,60:157- 180.

[3] 王敏捷,胡卫列.氯硝柳胺抗肿瘤分子机制的研究进展[J].现代医学,2017,45(1):138- 143.

[4] GOTTESMAN M M.Mechanisms of cancer drug resistance[J].Annu Rev Med,2002,53:615- 627.

[5] JARDETZKY O.Simple allosteric model for membrane pumps[J].Nature,1966,211(5052):969- 970.

[6] DEAN M,HAMON Y,CHIMINI G.The human ATP- binding cassette(ABC) transporter superfamily[J].J Lipid Res,2001,42(7):1007- 1017.

[7] JULIANO R L,LING V.A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants[J].Biochim Biophys Acta,1976,455(1):152- 162.

[8] GOTTESMAN M M,PASTAN I.Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter[J].Annu Rev Biochem,1993,62:385- 427.

[9] SCHINKELl A H.The physiological function of drug- transporting p- glycoproteins[J].Semin Cancer Biol,1997,8(3):161- 170.

[10] SHUSTIK C,DALTON W,GROS P.P- glycoprotein- mediated multidrug resistance in tumor cells:biochemistry,clinical relevance and modulation[J].Mol Aspects Med,1995,16(1):1- 78.

[11] JOHNSTONE R W,RUEFLI A A,SMYTH M J.Multiple physiological function for multidrug transporter p- glycoprotein[J].Trends Biochem Sci,2000,25(1):1- 6.

[12] OSTERBERG T,NORINDER U.Theoretical calculation and prediction of p- glycoprotein- interacting drugs using Molsurf parametrization and PLS statistics[J].Eur J Pharm Sci,2000,10(4):295- 303.

[13] HO R H,KIM R B.Transporters and drug therapy:implications for drug disposition and disease[J].Clin Pharmacol Ther,2005,78(3):260- 277.

[14] AMBUDKAR S V,DEY S,HRYCYNA C A,et al.Biochemical,cellular,and pharmacological aspects of the multidrug transporter[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1999,39:361- 398.

[15] GOLDSTEIN L J,GALSKI H,FOJO A,et al.Expression of a multidrug resistance gene in human cancers[J].J Natl Cancer Inst,1989,81(2):116- 124.

[16] GODA K Z,BASCO Z,SZABO G.Multidrug resistance through the spectacle of p- glycoprotein[J].Curr Cancer Drug Targets,2009,9(3):281- 297.

[17] FORD J M,HAIT W N.Pharmacologic circumvention of multidrug resistance[J].Cytotechnology,1993,12(1- 3):171- 212.

[18] KRISHNA R,MAYER L D.Multidrug resistance(MDR) in cancer:mechanisms,reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs[J].Eur J Pharm Sci,2000,11(4):265- 283.

[19] LAMPIDIS T J,KRISHAN A,PLANAS L,et al.Reversal of intrinsic resistance to adriamycin in normal cells by verapamil[J].Cancer Drug Deliv,1986,3(4):251- 259.

[20] KRISHAN R,de JONG G,MAYER L D.Pulsed exposure of SDZ PSC833 to multidrug resistant P388/adr and MCF7/ADR cells in the absense of anticancer drugs can fully restore sensitivity to doxorubicin[J].Anticancer Res,1997,17(5a):3329- 3334.

[21] PECK R A,HEWETT J,HARDING M W,et al.Phase I and pharmacokinetic study of the novel MDR1 and MRP1 inhibitor biricodar administered alone and in combination with doxorubicin[J].J Clin Oncol,2001,19(12):3130- 3141.

[22] ALTENBERG G A,VANOVE C G,HORTON J K,et al.Unidirectional fluxes of rhodamine 123 in multidrug- resistant cells:evidence against direct drug extrusion from the plasma membrane[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91(11):4654- 4657.

[23] HIGGINS C F,GOTTESMAN M M.Is the multidrug transporter a flippase?[J].Trends Biochem Sci,1992,17(1):18- 21.

[24] ALLER S G,YU J,WARD A,et al.Structure of P- glycoprotein reveals a molecular basis for poly- specific drug binding[J].Science,2009,323(5922):1718- 1722.

[25] ZIYAD B,AFSANEH L.P- glycoprotein inhibition as a therapeutic approach for overcoming multidrug resistance in cancer:current status and future perspectives[J].Curr Cancer Drug Targets,2013,13(3):326- 346.

[26] MATOS A M,REIS M,DUARTE N,et al.Epoxylathyol derivatives:modulation of ABCB1- mediated multidrug resistance in human colon adenocarcinoma and mouse T- lymphoma cells[J].J Nat Prod,2015,78(9):2215- 2228.

[27] KIM M K,PARK K S,CHOO H,et al.Quercetin- POM(pivaloxymethyl) conjugates:Modulatory activity for P- glycoprotein- based multidrug resistance[J].Phytomedicine,2015,22(7- 8):778- 785.

[28] MACKEIGAN J P,MURPHY L O,BLENIS J.Sensitized RNAi screen of human kinases and phosphatases identifies new regulators of apoptosis and chemoresistance[J].Nat Cell Biol,2005,7(6):591- 600.

[29] WANG F,CHEN Y,HUANG L,et al.Cetuximab enhanced the efficacy of chemotherapeutic agent in ABCB1/P- glycoprotein- overexpressing cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(38):40850- 40865.

[30] HU Z,ZHOU Z,HU Y,et al.HZ08 reverse P- glycoprotein mediated multidrug resistanceinvitroandinvivo[EB/OL].[2015- 02- 17].https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116886.

[31] MOTOMURA S,MOTOJI T,TAKANASHI M,et al.Inhibition of P- glycoprotein and recovery of drug sensitivity of human acute leukemic blast cells by multidrug resistance gene(mdr1) antisense oligonucleotides[J].Blood,1998,91(9):3163- 3171.

[32] Alahari S K,DEAN N M,FISHER M H,et al.Inhibition of expression of the multidrug resistance- associated P- glycoprotein of by phosphorothioate and 5′ cholesterol- conjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides[J].Mol Pharmacol,1996,50(4):808- 819.

[33] RAO D D,VORHIES J S,SENZER N,et al.siRNA vs.shRNA:similarities and differences[J].Adv Drug Deliv Rev,2009,61(9):746- 759.

[34] WU Y,ZHANG Y,ZHANG W,et al.Reversing of multidrug resistance breast cancer by co- delivery of P- gp siRNA and doxorubicin via folic acid- modified core- shell nanomicelles[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2016,138:60- 69.

[35] ZHANG C G,ZHU W J,LIU Y,et al.Novel polymer micelle mediated co- delivery of doxorubicin and P- glycoprotein siRNA for reversal of multidrug resistance and synergistic tumor therapy[EB/OL].[2016- 03- 31].https://doi.org/10.1038/srep23859.

[36] ZAUNG A J,CECH T R.The intervening sequence RNA of Tetrahymena is an enzyme[J].Science,1986,231(4737):470- 475.

[37] GAO P,ZHOU G Y,GUO L L,et al.Reversal of drug resistance in breast carcinoma cells by anti- mdr1 ribozyme regulated by the tumor- specific MUC- 1 promoter[J].Cancer Lett,2007,256(1):81- 89.

[38] SCOTTO K W,JOHNSON R A.Transcription of the multidrug resistance gene MDR1:a therapeutic target[J].Mol Interv,2001,1(2):117- 125.

[39] CHEN T,WANG C,LIU Q,et al.Dasatinib reverses the multidrug resistance of breast cancer MCF- 7 cells to doxorubicin by downregulating P- gp expression via inhibiting the activation of ERK signaling pathway[J].Cancer Biol Ther,2015,16(1):106- 114.

[40] JANSSON P J,YAMAGISHI T,ARVIND A,et al.Di- 2- pyridylketone 4,4- dimethyl- 3- thiosemicarbazone(Dp44mT) overcomes multidrug resistance by a novel mechanism involving the hijacking of lysosomal P- glycoprotein(Pgp)[J].J Biol Chem,2015,290(15):9588- 9603.

[41] URBATSCH I L,SENIOR A E.Effects of lipids on ATPase activity of purified Chinese hamster P- glycoprotein[J].Arch Biochem Biophys,1995,316(1):135- 140.

[42] LESLIE E M,DEELEY R G,COLE S P.Multidrug resistance proteins:role of P- glycoprotein,MRP1,MRP2,and BCRP(ABCG2) in tissue defense[J].Toxicol Appl Pharmacol,2005,204(3):216- 237.