miR- 200c通过靶向调节AHNAK抑制胰腺癌细胞的侵袭

顾兴伟，周家华

(东南大学附属中大医院 普外科，江苏 南京 210009)

胰腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发生发展过程受到多种编码基因与非编码基因的调控[1]。MicroRNA(miRNAs)是一类小片段(20～22个核苷酸)的非编码RNA，miRNA的表达失衡对胰腺癌的侵袭转移具有重要影响[2- 3]。miRNA- 200c属于miRNA- 200家族，具有调控肿瘤侵袭的作用[4- 5]。已有研究表明，miR- 200c在胰腺癌组织中表达降低[6]。并且胰腺癌干细胞中miR- 200c的表达降低，而miR- 200c过表达能够抑制胰腺癌干细胞的生长及侵袭[7]。然而关于miR- 200c是否参与调控胰腺癌细胞侵袭及机制仍然有待进一步研究。本研究以胰腺癌细胞SW1990和PANC- 1为研究对象，旨在探讨miR- 200c过表达对胰腺癌细胞侵袭的影响，为胰腺癌的防治提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人胰腺癌细胞SW1990、PANC- 1购自中国科学院上海细胞所，常规传代培养；DMEM培养液、胎牛血清及胰酶购自Gibco公司；脂质体转染Lipofectamine2000、Trizol及PCR扩增试剂盒购自Invitrogen公司；SYBR green PCR mix购自TaKaRa公司；miR- 200c引物、U6引物、miR- 200c类似物(miR- 200c mimics)及其阴性对照(Scramble)购自GenePharma公司；PMSF、RIPA裂解液购自碧云天公司；Matrigel购自BD公司；Super ECL Plus试剂盒、BCA试剂盒购自Pierce公司；AHNAK兔抗人多克隆抗体(sc- 98373)、β- actin兔抗人多克隆抗体(sc- 130656)购自Santa Cruz Biotechnology公司；pmirGLO载体、Dual- luciferase检测试剂盒购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 含10%胎牛血清的DMEM培养基中加入合适体积的人胰腺癌细胞SW1990和PANC- 1，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，根据细胞生长密度更换新鲜培养基或传代培养。

1.2.2 细胞转染 将以1×105对数期生长的人胰腺癌细胞SW 1990及PANC- 1接种于6孔培养板中，细胞生长密度至60%～70%时，根据脂质体转染Lipofectamine2000说明书分别转染miR- 200c mimics及其阴性对照。

1.2.3 RNA提取及RT- PCR 使用Trizol从细胞中分离提取出总RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR green PCR mix在StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行RT- PCR。miR- 200c和U6扩增引物购买自GenePharma公司，其中U6为内参对照，各组相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 Transwell细胞侵袭实验 按照试剂盒的说明书要求，使用8 μm孔径的室评估细胞迁移。在Transwell上室中加入100 μl Matrigel，2 h凝固后将含有105个细胞的200 μl无血清DMEM培养基加入Transwell上室中，将含10%FBS的200 μl DMEM培养基加入到下室中。细胞在37 ℃、5%CO2中孵育。培养24 h后用棉签刮去Transwell上室内的细胞，固定并用0.1%结晶紫染色迁移至膜底部的细胞，通过显微镜观察并计数。

1.2.5 生物信息学方法预测miR- 200c靶基因 采用TargetScan、PicTar和miranda数据库预测miR- 200c的靶基因，使用miranda数据库预测靶基因AHNAK的3′非翻译区(3′UTR)与miR- 200c的结合位点。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验 构建靶基因AHNAK的3′UTR(野生型3′UTR)与miR- 200c的结合位点突变的序列(突变型3′UTR)。AHNAK的野生型或突变型3′UTR亚克隆至pmirGLO载体中，构建pmirGLO- AHNAK- wt和pmirGLO- AHNAK- mut。实验分为4组：(1)Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt；(2)Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut；(3)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt；(4)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut。在SW1990及PANC- 1细胞中，按照上述分组进行转染实验。按照Dual- luciferase试剂盒说明书检测萤火虫和海肾荧光素酶活性，海肾萤光素酶活性作为内参对照。

1.2.7 蛋白免疫印迹检测 用含有PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，利用BCA试剂盒测量蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脱脂牛奶封闭。膜与AHNAK或β- actin抗体4 ℃孵育过夜，再使用辣根过氧化物酶标记的二抗与膜室温孵育1 h。使用Super ECL Plus试剂盒进行信号检测，其中β- actin为内参对照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据描述用均数±标准差，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA- 200c的表达

RT- PCR结果显示，在SW1990与PANC- 1细胞中，相比转染阴性对照组转染miR- 200c mimics 24 h后miR- 200c的表达明显增高，差异具有统计学意义(图1)。

*与对照组比较，P<0.05

图1RT-PCR检测SW1990与PANC-1细胞中miR-200c的相对表达量

Fig1RelativeexpressionofmiR-200cinSW1990andPANC-1cellswasdetectedbyRT-PCRassay

2.2 miR- 200c过表达对胰腺癌细胞侵袭的影响

Transwell细胞侵袭实验结果显示，与对照组相比人胰腺癌细胞株SW1990及PANC- 1过表达miR- 200c后SW1990与PANC- 1细胞的侵袭能力显著减弱(图2)。

图2miR-200c过表达对胰腺癌细胞SW1990及PANC-1侵袭的影响

Fig2EffectsofmiR-200coverexpressiononinvasioninSW1990andPANC-1pancreaticcancercells

2.3 AHNAK是miR- 200c的靶标

生物信息学结果显示，miR- 200c可特异结合AHNAK 3′UTR区域，结合位点如图3A所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt共转染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt共转染至SW1990和PANC- 1细胞，荧光素酶活性显著降低。但是，与Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut共转染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut共转染至SW1990和PANC- 1细胞，荧光素酶活性基本不变(图3B)。上述结果表明，miR- 200c能够与AHNAK基因的3′UTR结合。

2.4 miR- 200c过表达对AHNAK蛋白表达的影响

蛋白免疫印迹检测结果显示，在人胰腺癌细胞SW1990和PANC- 1中，与对照组相比过表达miR- 200c能够显著抑制AHNAK的蛋白表达(图4)。

*与对照组比较，P<0.05

图3miR-200c能够与AHNAK基因的3′UTR区结合

Fig3MiR-200cspecificallybindsAHNAK3′UTR

图4miR-200c过表达对胰腺癌细胞SW1990和PANC-1中AHNAK蛋白表达的影响

Fig4EffectsofmiR-200coverexpressiononAHNAKproteinexpressioninSW1990andPANC-1cells

3 讨 论

胰腺癌是美国男性和女性癌症死亡的第4大常见原因[8]。尽管临床医师和科学家在不断地努力，但胰腺癌患者5年生存率仍较低[9]。在2000年至2011年期间，中国男性胰腺癌发病率逐年上升[10]。胰腺癌恶性程度高，在发病早期极易发生局部侵袭和远处转移，使得传统手术、放疗以及化疗的疗效差[11]。近年来的研究发现，microRNA通过与其靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)相互作用调节基因的表达，在生物体内起到致癌或者抑癌作用[12]。比如，miR- 451通过靶向调节CAB39促进胰腺癌细胞增殖和转移[13]，发现miR- 1271通过靶向调节ZEB1和TWIST1抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化[14]。

钙调蛋白AHNAK亦称桥粒联结蛋白(desmoyokin)，在多种细胞类型中表达[15]。最近的证据表明，AHNAK具有促进肿瘤转移的能力[16]。AHNAK能够促进伪足形成、细胞迁移和侵袭、增强肌动蛋白活性、诱导上皮间质转化从而促进细胞转移[17]。在间皮瘤细胞中，降低AHNAK的表达能显著降低细胞的迁移和侵袭能力[18]。以上研究成果均表明，AHNAK在肿瘤的迁移与侵袭中发挥着重要的作用。

miR- 200是一类抑制肿瘤的miRNA家族，其包括miR- 200a、miR- 200b、miR- 200c、miR- 141和miR- 429，并参与肿瘤的发生和发展[19]。miR- 200c作为miR- 200家族的重要成员之一，在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。miR- 200c可以通过靶向调节Bmi- 1和E2F3抑制肾癌细胞的生长和转移[20]，而miR- 200c通过靶向调节FN1能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[21- 22]。我们研究结果显示，在人胰腺癌SW1990和PANC- 1细胞中过表达miR- 200c显著降低胰腺癌细胞的侵袭能力，并且miR- 200c能够与AHNAK的3′UTR结合并下调AHNAK的蛋白表达水平。综上所述，miR- 200c过表达可通过靶向调节AHNAK的蛋白表达而抑制胰腺癌细胞的侵袭。

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