远端缺血预处理及创伤预处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用及抗氧化能力的比较

柴青，张可贤，唐育民，李桂芳

(四川省肿瘤医院·研究所 麻醉医学中心/四川省癌症防治中心，四川 成都 610041)

随着围术期医学的提出，临床麻醉医师和外科医师对合并有各种慢性疾病的老年人的围术期安全及其脏器功能保护越来越重视[1]。在众多影响围术期安全的因素中，组织器官所承受的缺血再灌注损伤是影响病人生存率和死亡率的一个重要因素,1986年Murry等[2]首次提出了缺血预处理(ischemia preconditioning，IPC)的概念，指出一个短暂间断的缺血再灌注过程能够诱导机体产生保护机制，从而减轻之后长时间的缺血再灌注损伤。1993年Przyklenk等[3]又提出了远端缺血预处理(remote ischemia preconditioning)的概念，既通过远离目标器官部位的短暂缺血来达到保护目标脏器抵御缺血再灌注损伤的目的。2004年Ren等[4]发现了一种新的心肌保护现象，他们观察到给予腹部切口的小鼠，其心肌缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积较对照组明显减少，他们将这种非缺血预处理现象命名为“远端创伤预处理”(remote preconditioning of trauma)。在之后的研究中科学家指出，腹部切口通过切口部位的伤害性感受器刺激神经信号的传导，通过脊神经通路兴奋了心脏的交感神经系统，进而促进一些内源性介质的释放，产生了对心肌的保护作用。虽然物理方法的远端创伤预处理无法在临床上实践,但是辣椒素能够激活皮肤上的C感觉纤维，产生模拟远端创伤预处理的心肌保护作用，这也为远端创伤预处理的临床应用提供了一条崭新的道路。

相较于远端缺血预处理，远端创伤预处理方面的研究还很少，这两种截然不同的预处理方法谁的心肌保护作用更强还不得而知，如果两者联合应用是否能增强心肌保护作用也不确定。鉴于使用药物可能因为个体差异及使用剂量的不确定性而难以达到较好的和一致的远端创伤预处理效果，故本研究采用对大鼠腹部切开的物理方法进行远端创伤预处理，来比较远端创伤预处理与远端缺血预处理的优劣以及联合运用的效果，进而论证在临床实际应用中这两者如何取舍，以便于临床决策的制定。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

50只雄性7周龄SD大鼠，体重250～300 g，由四川省动物中心提供，给予相同饲料喂养于相同环境下(气温23 ℃，湿度60%，12 h的昼夜交替)。用电脑自动生成的随机数字表将大鼠随机分为5组，实验流程见图1。假手术组，仅开胸；对照组，仅开胸建立心肌缺血再灌注损伤模型；远端创伤缺血预处理组(创伤缺血组)，腹部正中横切口开腹2 cm作为创伤刺激，并阻断双侧股动脉5 min，再灌注5 min，反复3个循环，缝合腹部切口，再建立心肌缺血再灌注损伤模型；远端创伤预处理组(创伤组)，腹部正中横切口开腹2 cm,30 min后缝合切口，再建立心肌缺血再灌注损伤模型；远端缺血预处理组(缺血组)，不开腹，仅阻断双侧股动脉5 min，再灌注5 min，反复3个循环，再建立心肌缺血再灌注损伤模型。

图1实验流程图

1.2 主要试剂及仪器

大鼠肌钙蛋白I检测试剂盒(ELISA)(武汉Uscn生命科学有限公司)，TUNEL染色试剂盒(美国Promega公司)，4,6- 联脒- 2- 苯基吲哚(DAPI)染料(美国Sigma化学公司)。

小动物呼吸机和生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，血气分析仪(美国Radiometer Medical Aps.)，离心机(美国COULTER公司)，酶标仪(美国Bio- Tek仪器公司)，自动生化仪(深圳Mindray公司)，石蜡封片机、切片机、荧光显微镜(德国LEICA公司)。

1.3 实验步骤

(1)大鼠称重并记录数据，用保温毯保持体温在37 ℃。(2)予2%戊巴比妥钠50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，麻醉满意后仰卧固定于手术台上，术中每60 min给予25 mg·kg-1的剂量维持麻醉。(3)气管切开接呼吸机，设置呼吸参数为：氧浓度40%，呼吸机频率60～70次·min-1，潮气量2.5～3.5 ml，吸呼比1∶2。(4)右颈总动脉置管接换能器记录心率、血压。标准肢体Ⅱ导联连接心电图。(5)按实验分组在不同部位予以相应预处理措施，再建立心肌缺血再灌注模型(在左心耳下缘冠状动脉左前降支中点位置以6- 0带针线缝扎血管，造成心肌缺血30 min，松开缝线给予再灌注180 min)。实验过程中注意监测、记录实验开始前，预处理后，洗脱期后，心肌缺血后，心肌再灌注1、2、3 h时的血压水平。(6)冠状动脉结扎成功的判断标准：ST段改变(ST段抬高或下移，T波高耸或倒置)；心律失常(可见室性心律失常如室性早搏、阵发或非阵发室性心动过速，房室传导阻滞和室内阻滞等)；结扎远端局部发白；血压下降。(7)排除标准：平均动脉压持续低于60 mmHg且难以回复，或者失血过多实验结束时血红蛋白含量低于50 g·L-1。

1.4 标本处理及数据测定

心肌再灌注180 min后经颈动脉置管取血，离心留取上清，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)，自动生化仪测定血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase- MB,CK- MB),酶联免疫吸附法测定肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)。

处死大鼠后取其心脏，将心尖到缺血远端部位制作石蜡标本，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated deoxyuridine triphosphate nick- end labeling assay,TUNEL)行荧光染色，正常细胞被染成蓝色，凋亡细胞被染成绿色，荧光显微镜下观察，每个标本取5个高倍镜视野，通过Image J 1.44p软件计算凋亡指数(apoptotic index,AI)，AI定义为凋亡细胞总数与所有细胞总数之比。

1.5 统计学处理

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件，组间比较行单因素方差分析，两两比较使用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血流动力学指标

实验过程中各组血压情况见表1。大鼠基础血压组间比较差异无统计学意义。实验结束时假手术组血压最高，为(119±26.2)mmHg，对照组血压最低，为(101±21.8)mmHg，两组之间差异有统计学意义(P=0.034)；假手术组血压与各实验组间比较差异无统计学意义。

表1 大鼠平均动脉血压 mmHg

a 与假手术组比，P<0.05

2.2 氧化抗氧化指标及心肌损伤标记物指标

各组血清MDA、SOD、LDH、CK- MB、cTnI测值及比较如图2。假手术组及对照组血清MDA水平分别为(3.5±0.6)nmol·ml-1和(4.8±0.7)nmol·ml-1，差异有统计学意义。创伤缺血组为(3.7±1.0)nmol·ml-1,创伤组为(3.7±0.6)nmol·ml-1，缺血组为(3.6±0.8)nmol·ml-1，3个实验组与假手术组比较没有差异，而与对照组比较差异均有统计学意义。假手术组血清SOD水平为(161.1±39.3)U·ml-1，对照组为(117.4±25.8)U·ml-1，两组比较差异无统计学意义。创伤缺血组为(176.5±65.6)U·ml-1，创伤组为(195.5±65.5)U·ml-1,缺血组为(171.2±31.0)U·ml-1，与假手术组比较差异均无统计学意义，而与对照组比较差异均有统计学意义。血清LDH水平对照组最高，为(911.1±265.5)U·L-1，最低为假手术组的(290.3±65.9)U·L-1，3个实验组分别为(511.2±89.9)U·L-1、(616.2±182.2) U·L-1和(622.0±112.5)U·L-1，实验组与对照组和假手术组比较差异均有统计学意义。血清CK- MB水平仍是对照组最高，为(413.0±99.5)U·L-1，假手术组最低，为(180.5±62.5)U·L-1，对照组与创伤缺血组[(246.0±52.7)U·L-1]、创伤组[(218.2±62.8)U·L-1]、缺血组[(186.0±68.3)U·L-1]之间两两比较差异有统计学意义。cTnI水平在假手术组最低，为(42.5±6.5)pg·ml-1，对照组最高，为(60.1±12.1)pg·ml-1，两组差异有统计学意义。3个实验组分别为：创伤缺血组(44.1±5.9)pg·ml-1、创伤组(43.7±8.3) pg·ml-1、缺血组(42.7±4.7)pg·ml-1，均与假手术组无差异，而与对照组比则均有差异。

a 与假手术组比，P<0.05;b 与对照组比，P<0.05

图2大鼠血清MDA、SOD、LDH、CK-MB、cTnI箱式图

2.3 心肌细胞AI

大鼠心肌细胞凋亡染色如图3，心肌细胞AI统计学分析如图4。假手术组AI最低，为(5.26±4.99)%，与其他4组比较差异均有统计学意义。对照组AI最高，为(31.75±10.65)%，创伤缺血组为(18.32±9.30)%，与对照组比差异有统计学意义(P=0.016)，创伤组为(18.51±9.26)%，与对照组比差异也有统计学意义(P=0.017)，缺血组为(20.41±3.86)%，与对照组比差异同样有统计学意义(P=0.038)，但3个实验组间比较差异无统计学意义。

凋亡细胞染成绿色，正常细胞染成蓝色

图3大鼠心肌细胞TUNEL染色荧光照片×400

3 讨 论

远端缺血和创伤预处理作为两种比较有前景的预处理方法，我们的研究对其优劣及联合应用的必要性进行了论证。结果显示，实验结束后3个实验组的氧化抗氧化指标、心肌损伤血清学指标及心肌细胞AI均与对照组有统计学差异，显示出了预处理措施对心肌的保护作用。而3个实验组之间两两比较则差异无统计学意义，也就是说无论是单独运用远端缺血预处理还是单独运用远端创伤预处理，或者两者联合运用，均能起到保护心肌抵抗缺血再灌注损伤的作用，但是联合应用两种预处理方法并不能增强对心肌的保护作用。

我们认为，3种预处理方式的心肌保护效果相当是由于其作用机制的殊途同归导致的。远端缺血预处理的作用是通过释放体液介质或者神经调质或者两者联合来发挥的[5]，这些介质包括腺苷、缓激肽、热休克蛋白、肿瘤坏死因子- α、一氧化氮、阿片类物质等等[6- 8]。而远端创伤预处理可能主要依靠神经途径发挥作用，腹部皮肤外周感觉神经的疼痛性刺激能够通过胸9- 10脊神经激活心脏的感觉神经，使心脏交感神经释放去甲肾上腺素和缓激肽，进而发挥对心脏的保护作用[9]。但两者最后通过活性介质在心脏局部引起保护作用的信号转导途径是相似的，都能引起蛋白激酶C活化，ATP敏感的线粒体钾通道开放，抑制细胞凋亡，促进保护因子合成等[6,9- 12]。

a 与假手术组比，P<0.05；b 与对照组比，P<0.05

图4大鼠心肌细胞AI箱式图

基于以上结果我们认为，在临床实践决策时对于需行腹部大手术的患者可以不必再给予远端缺血预处理来保护其脏器功能，因为其腹部切口已经相当于对其进行了远端创伤预处理；而对于行腹部手术以外的其他非心脏手术的患者以及行微创腔镜手术的患者，远端创伤预处理是不可行的，此时给予远端缺血预处理就能发挥一定的脏器保护作用。

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