炎症小体蛋白AIM2负调节抗RNA病毒反应发生

李健，刘雪，杨硕

(南京医科大学 基础医学院，江苏 南京 211166)

在清除病原感染过程中一类被称为炎症小体(inflammasome)的固有免疫细胞多蛋白复合体发挥了重要的作用。炎症小体通过其核心蛋白NLR(NOD- like receptor)或PYHIN(Pyrin and HIN domain- containing)感应细菌和病毒等病原刺激，在有或没有接头蛋白ASC(apoptosis- associated speck- like protein containing a CARD)的帮助下，激活蛋白酶Caspase- 1和Caspase- 11(人中Caspase- 4/5)，然后促进炎症因子IL- 1β和IL- 18前体剪切成熟和释放，诱导炎症反应来激活固有免疫防御和适应免疫应答的发生[1]。此外最近还发现炎症小体能剪切激活GSDMD蛋白，随后GSDMD蛋白N端寡聚化与胞膜结合来诱导焦亡(pyroptosis)形成，促进了炎症反应发生以及胞内寄生病原释放和清除[2- 3]。炎症小体不仅可识别病原还可感知体内危险信号，参与了机体慢性炎症反应疾病的发生。根据炎症小体组成和结构，当前研究较多的炎症小体主要包括NLRP3、NLRC4、NLRP1和AIM2等，其中AIM2炎症小体核心蛋白AIM2的C端包含有HIN- 200结构域，能识别病毒双链DNA来激活炎症小体组装[4]。已有报道病毒感染会引起线粒体压力诱导的线粒体活性氧(mROS)产生，进而激活NLRP3炎症小体引起炎症反应，参与抗病毒反应[5]。虽然病毒激活炎症小体诱导炎症反应产生已被广泛报道，但炎症小体本身是否能直接调控抗病毒通路目前还是了解不多。最近Immunity上有报道，炎症小体ASC、Caspase- 1/11和AIM2分子可通过Caspase- 1/11激活来切割DNA病毒识别受体cGAS，进而负调节DNA病毒诱导的抗病毒反应，维持抗病毒炎症反应的平衡[6]。由于固有免疫抗病毒作用通路复杂，是否炎症小体蛋白在抗病毒反应中还存在其它调节作用，以及是否能调节抗RNA病毒反应仍需深入研究。

在本研究中，我们通过基因敲除方法发现AIM2分子可以负调节RNA病毒诱导的抗病毒反应。相对于野生型巨噬细胞，AIM2基因敲除细胞在RNA病毒感染后有更少的病毒存在，与此相一致，抗病毒效应分子在AIM2敲除细胞中表达明显升高。机制上我们发现AIM2基因敲除可促进RNA抗病毒通路下游TBK1和IRF3的激活。因此，本研究丰富了我们对炎症小体在抗病毒通路调节功能的认识，并为深入理解影响抗病毒反应的调控机制提供了线索。

1 材料和方法

1.1 材料

AIM2敲除小鼠由Genentech公司提供，VSV- GFP(vesicular stomatitis virus carrying green fluorescent protein)/HSV- GFP(herpes simplex virus carrying green fluorescent protein)病毒、Vero细胞由广州医科大学免疫所赠送，Sendai virus(SEV)购自Charles river公司，Poly(I∶C)购自Invivogen公司，甲基纤维化素、结晶紫由Sigma公司购得，DMEM和1640培养基、胎牛血清、双抗、胰酶由GIBCO公司购得，Trizol试剂盒由Invitrogen公司购得，IFNβ Elisa试剂盒由作者所在实验室自己制备，IL- 6 ELISA试剂盒于R&D公司购得。

1.2 方法

1.2.1 病毒的制备与滴度检测

1.2.1.1 病毒的制备 按常规方法培养Vero细胞，当细胞汇合度达80%～90%时制备病毒液。将T175培养瓶中10%FBS DMEM培养基吸干。加入8 ml 2%FBS DMEM培养基，HSV以感染复数(multiplicity of infection, MOI)0.01感染细胞，VSV以MOI 0.4感染细胞，置于培养箱中，2 h后补充培养基至20 ml，VSV12～18 h后、HSV24～36 h后细胞变性80%，细胞刮刮取细胞收集到离心管，3 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集上清并加入适量培养基重悬细胞，将细胞于-80 ℃/4 ℃反复冻融3次让病毒析出，再3 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集上清，和第1次收集上清混匀，分装后-80 ℃保存。

1.2.1.2 病毒的滴度检测 6孔板，每孔铺3×105Vero细胞，过夜培养，细胞汇合度90%左右时进行滴度测定。将病毒梯度稀释，6孔板吸净培养基，加入不同梯度稀释的病毒液(一般为10-5、10-6、10-7)，每个梯度做两个复孔，放入培养箱培养1 h，期间每15 min晃动1次，吸净病毒稀释液，随后加入4 ml 1.2%甲基纤维化素与2%FBS DMEM培养基混液，培养箱培养2～3 d，吸掉甲基纤维化素液，加入0.5 ml·孔-14%多聚甲醛固定15 min，弃掉多聚甲醛加入0.5 ml·孔-1结晶紫染色1 h，洗脱结晶紫，倒置晾干，空斑计数，计算公式：病毒滴度PFU/ml=平均空斑数×稀释倍数。

1.2.2 原代小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)分离与培养

处死的小鼠用75%酒精浸泡2 min，晾干酒精后后肢脱毛至足，剪下后肢，于培养皿中剔除肌肉，沿大转子剪下股骨，用PBS清洗两遍，再用1ml注射器取1640培养基注入骨髓腔冲洗2～3次，收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，再用10%L929上清的1640培养基重悬细胞并于T75培养瓶培养，隔天换液，至第5天贴壁细胞为BMDMs，胰酶消化，1.5106孔-1种板，培养箱过夜，病毒刺激检测mRNA或取细胞上清ELISA检测蛋白表达。

1.2.3 分离mRNA，逆转录和实时定量PCR分析

Trizol试剂盒提取细胞总RNA，取500 ng RNA逆转录，定量PCR检测基因表达，详细实验步骤见试剂盒。引物序列如下:Ifnβ sense 5- CCCTATGGAGATGACGGAGA- 3, antisense 5- CCCAGTGCTGGAGAAATTGT- 3;Ifnα sense 5- CTTTCCTCATGATCCTGGTAATGAT- 3,antisense 5- AATCCAAAATCCTTCCTGTCCTTC- 3;Cxcl10 sense 5- AAGTGCTGCCGTCATTTTCTG- 3,antisense 5- TTCCCTATGGCCCTCATTCTC- 3;Il6 sense 5- CTTGGGACTGATGCTGGTGAC- 3,antisense 5- GCCATTGCACAACTCTTTTCTC- 3。

1.2.4 ELISA检测蛋白表达

ELISA检测细胞分泌IFNβ表达,PBS缓冲液稀释IFNβ一抗(Santa Cruz sc- 57201)，100 μl·孔-1铺板过夜，洗板3次，加入100 μl样品，常温孵育2 h，洗板3次，加入Detection抗体(R&D 32400- 1)，100 μl·孔-1，常温2 h，洗板6次，加入HRP(R&D)，100 μl·孔-1常温2 h，洗板9次，100 μl·孔-1TMB(Moss substrates)显色液显色，10%硫酸终止，酶标仪读取吸光值。IL- 6 ELISA检测详见试剂盒说明书(R&D 128967)。

1.2.5 流式细胞仪检测病毒绿色荧光蛋白(GFP)

VSV- GFP或HSV- GFP以MOI1感染12孔板中BMDM，24 h后刮取细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，1 ml PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测病毒GFP表达，数据用Flowjo软件分析。

1.2.6 Western blot检测

病毒刺激3、6 h后的BMDM细胞加入细胞裂解液提取蛋白，加入4倍上样缓冲液加热变性，9%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，用抗目的蛋白一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，5 min·次-1，二抗(Licor)室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，5 min·次-1，Odyssey扫膜。使用一抗包括：p- TBK1(CST 5483S)、p- IRF3(CST 4947)、AIM2(CST 13095S)、p- IKBα(CST 28595)和β- ACTIN(SIGMA A5441)。

1.3 统计学处理

SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用Two- way ANOVA unpairedt检验，*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001。

2 结 果

2.1 AIM2基因缺失抑制RNA病毒在细胞中的复制

为探究AIM2在抗RNA病毒反应中的角色，在WT和AIM2-/-BMDMs中，以MOI 1分别感染RNA病毒VSV- GFP和DNA病毒HSV- GFP 24 h后流式细胞仪检测病毒GFP含量，对比WT BMDM，AIM2-/-BMDM中GFP明显下降(图1)，该结果说明AIM2不仅负调节DNA病毒也负调节RNA病毒清除。

WT和AIM2-/-小鼠BMDM病毒刺激24 h后，流式细胞仪检测病毒报告基因蛋白GFP表达量，实验重复2次

图1AIM2基因缺失抑制RNA病毒在细胞中的复制

2.2 AIM2基因缺失促进抗病毒炎症因子基因表达

在BMDMs中分别感染单股负链RNA病毒VSV、SEV、Poly(I∶C)以及DNA病毒HSV后，进行定量PCR检测，对比WT BMDM，AIM2-/-BMDM细胞抗病毒炎症因子mRNA表达水平均明显上调(图2)，该结果说明AIM2负调节了抗RNA病毒炎症反应的发生。

定量PCR检测WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、HSV、SEV 12 h，1g·ml-1Poly(I∶C)刺激8 h后Ifnβ、Ifnα、Cxcl10和Il6的mRNA表达水平，实验重复3次

图2AIM2负调节抗RNA病毒炎症因子基因表达

2.3 AIM2基因缺失促进抗病毒炎症因子分泌

为进一步分析AIM2对抗病毒炎症因子表达的影响，在BMDMs中分别感染VSV、SEV、Poly(I∶C)以及HSV后检测培养基中炎症因子。对比WT BMDM，AIM2-/-BMDM细胞培养基中抗病毒炎症因子表达明显上调(图3)，该结果进一步表明AIM2负调节了抗RNA病毒炎症因子产生。

2.4 AIM2基因缺失促进抗病毒信号通路表达

在BMDMs中分别感染VSV、SEV、HSV，Western blot检测抗病毒信号通路蛋白表达。对比WT BMDM, AIM2-/-BMDM全细胞裂解中抗病毒信号通路蛋白p- IRF3、p- TBK1、p- IKBα的表达明显上调(图4)，该结果表明AIM2负调节抗RNA病毒信号通路。

3 讨 论

炎症小体是机体固有免疫系统应对病原感染的重要蛋白质分子，但其在抗病毒反应中的角色目前了解不多。我们的研究表明，能与DNA核酸相结合的炎症小体蛋白AIM2不仅能负调节抗DNA病毒通路，而且也可以抑制抗RNA病毒反应。AIM2敲除巨噬细胞相对于野生型细胞存在更强RNA病毒诱导的TBK1和IRF3激活，产生更多的抗病毒基因和Ⅰ型干扰素，因而拥有更强的RNA病毒清除能力。

ELISA检测WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、SEV、HSV以及1 μg·ml-1Poly(I∶C)感染18 h后细胞培养基中IFNβ、IL- 6的蛋白表达水平，实验重复3次。

图3AIM2负调节抗RNA病毒炎症因子产生

Western blot检测WT和AIM2-/-BMDM在以MOI1感染VSV、SEV、HSV 3、6 h后抗病毒信号通路IRF3、TBK1和IKBα磷酸化水平，实验重复2次

图4AIM2负调节抗RNA病毒信号通路蛋白表达

最近有报道AIM2、ASC以及Caspase- 1/11在DNA病毒刺激后通过Caspase- 1/11切割cGAS蛋白来抑制抗DNA病毒反应，因此我们的发现拓展了对炎症小体调控抗病毒反应的认识。DNA结合炎症小体为什么能调节抗RNA病毒反应，是本研究将要探究的科学问题。目前有报道AIM2可以通过DNA链结合DNA- PK激酶来抑制DNA- PK对AKT激酶的活化，而AKT可以正向调控炎症通路NFkB以及抗病毒通路TBK1的活性[7- 8]。因此AIM2可能不仅通过炎症小体激活切割cGAS来负调节抗DNA病毒反应，也有可能采用其它机制调节抗病毒反应，即AIM2缺失释放了对DNA- PK激酶的抑制，进而激活AKT通路，AKT信号的激活又促进抗病毒反应的发生，在接下来研究中我们将对此假说作进一步探索。由于本研究主要是在小鼠细胞上进行，接下来工作中我们也将在人细胞以及动物体内水平来进一步研究AIM2在抗RNA病毒反应中的作用和机制。

AIM2负调节抗病毒反应可避免过度激活导致的自身免疫病发生[9]，我们的研究结果也表明AIM2可能是机体抵御自身免疫炎症疾病的重要效应分子。此外AIM2负调节抗RNA病毒通路也体现了炎症小体蛋白在机体固有免疫防御中作用的多样性，突出了炎症小体蛋白在固有免疫防御反应中的“非炎症小体功能”[10]。综上所述，本研究增加了对炎症小体抗病毒调节作用的认识，并为深入理解固有免疫系统抗病毒机制提供了线索。

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[3] SHI J,ZHAN Y,WANG K,et al.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J].Nature,2015,526(7575):660- 665.

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