基于SPME-GC-MS和PCA的不同萃取头对新疆烤羊肉香气成分萃取效果比较

席嘉佩，詹 萍*，田洪磊，王 鹏，耿秋月，王永晓，张 芳，姬云云

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）联用能够客观、准确、快捷地评价样品中的挥发性物质，且凭借其良好的重复性和稳定性能而被广泛应用于果酒、肉类、乳类等食品挥发性有机化合物的检测。近年来，国内外学者在分析传统烹饪食品[1]、发酵食品[2-3]、果汁饮料[4]、烟草[5]等产品的关键挥发性物质时发现，集萃取、浓缩（富集）、进样于一体的SPME技术，完全消除了由于萃取溶剂溶解效力而导致的萃取结果差异，并兼具方便、快捷、环保等优点。萃取头表面涂层的性质与关键挥发性香气物质结构可直接决定挥发性物质萃取分配系数的大小，所以选择合适涂层的萃取头是进行样品挥发性关键物质分析的前提条件。

目前相关报道多以挥发性物质色谱峰面积的整体呈现度作为SPME条件的优化目标。回瑞华等[6]采用不同萃取头萃取人参花蕾样品并经GC-MS分析后，根据挥发性物质总数目的差异选择75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取头为适用于人参花蕾的最优萃取头；杨继等[7]以各种挥发性萃取物的峰面积为指标，建立了电子烟烟液挥发性物质组分的SPME-GC-MS检测方法，并对5 种电子烟烟液进行了分析比较。由于对样品风味品质起决定作用的关键挥发性物质对萃取条件的要求各异，不同物质的香气阈值亦存在差异，且色谱峰总面积大并不能代表影响样品品质的关键香气物质的提取效果好，所以基于挥发性组分的相对面积及总量的方法优化实验方法、参数的思路并不可靠。为此，SPME方法的优化构建已成为相关学者关注的焦点，如郭静等[8]采用顶空SPME富集提取苹果汁中香气成分，利用模糊评判法构建综合评价模型对苹果汁香气萃取条件进行优化，为建立严谨的评价体系提供了思路；何小燕等[9]基于主成分分析（principal component analysis，PCA）模式研究了不同处理方式下鸡脂挥发性成分与化学指标之间的相关性；顾赛麒等[10]亦采用PCA等方法对各种淡水、海水蟹挥发性成分的相对气味活性值进行数理统计分析，获得了表征各种蟹类风味的可能关键特征性风味物质。

本研究采用SPME-GC-MS法探究不同萃取头对烤羊肉中挥发性香气组分的影响，结合PCA研究不同纤维涂层萃取头（50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS、85 μm PA、100 μm PDMS）与所萃取的挥发性物质之间的相关性，以灵敏度及关键共有香气物质含量作为评选最优萃取头的依据，进而选出最适宜用于烤羊肉挥发性物质萃取的SPME涂层萃取头。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤羊肉样品：取用新疆绵羊后腿肉及羊尾油切成2 cm×2 cm×2 cm盐腌1 h（肉盐比为100∶1（g/g）），肥瘦肉间隔放入烤箱（预热15 min），于210 ℃烤制15 min，使用粉碎机将烤羊肉粉碎成肉末。

C7～C40正构混标烷烃标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

手动SPME进样器 美国Supelco公司；7890B-5977A型GC-MS联用仪、HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；WNB22型精密数显恒温水浴槽 德国Memmert公司；KWS153OLX-H7G电烤箱 广东格兰仕集团有限公司；DFT-100手提式高速中药粉碎机 江苏同君仪器科技有限公司。萃取头型号见表1。

表1 SPME萃取头型号及特点Table 1 SPME fibers and their characteristics

1.3 方法

1.3.1 SPME-GC-MS测定条件

采用SPME方法进行风味物质提取，利用GC-MS联用仪进行挥发性物质成分分析。具体方法：分别称取粉碎后烤羊肉肉末5 g于15 mL顶空瓶中，边晃动顶空瓶边匀速加入1 mL的饱和NaCl溶液。将样品在40 ℃条件下平衡25 min（密封的瓶内有小水珠附着于内壁）。将老化后的5 种不同萃取头（100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm DVB/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS）分别插入密封的萃取瓶中，顶空萃取25 min，移至GC进样口于250 ℃解吸7 min。

GC条件：色谱柱为HP-INNOWAX石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（99.99%）；进样口温度250 ℃；柱流量为1.3 mL/min；进样方式为手动进样；分流比10∶1；程序升温：起始40 ℃，以6 ℃/min速率升至230 ℃，保持5 min，以15 ℃/min速率升至260 ℃。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；进样口温度260 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间1 min。

1.3.2 定性方法

通过GC-MS进行分析鉴定，将挥发性化合物的质谱信息与Wiley和NIST 14谱图库中已知化合物的质谱信息进行比对，依据相似度大于800的原则对鉴定化合物进行选取。同时依据Vandendool等[11]的方法测定保留指数（retention indices，RI），借用Standard Reference Data平台比对文献中化合物的线性保留指数（linear retention indices，LRI），对烤羊肉的挥发性风味成分进行定性分析。

1.4 数据处理

挥发性成分含量表示为峰面积，采用SPSS 23进行相关性分析及PCA，采用Origin 2016绘图。

2 结果与分析

2.1 5 种萃取头对烤羊肉中挥发性成分GC-MS分析

不同萃取头萃取烤羊肉样品中挥发性成分GC-MS分析结果如图1、表2所示。

图1 不同纤维涂层萃取头萃取烤羊肉中挥发性物质总离子流色谱图比较Fig. 1 Comparison of the total ion current chromatograms of volatile compounds in extracts from roasted mutton by different SPME fibers

2.2 基于有效检出峰数目与峰面积的萃取效果分析

表2 烤羊肉样品中挥发性成分GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis of volatile components in roasted mutton samples

2 种常用的萃取头萃取烤羊肉中挥发性物质的效果表明，同样条件下，5 种萃取头（75 μm CAR/PDMS 46 种 、65 μm DVB/PDMS 50种 、85 μm PA 25 种、100 μm PDMS 28 种、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 32 种）萃取挥发性物质种类之比为1.84：2∶1∶1.28∶1.12。从萃取香气成分的数量和种类来看，75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS萃取到的挥发性物质较多。由图2可知，75 μm CAR/PDMS的萃取头对醇类、醛酮类、脂肪烃类物质的萃取效果明显优于其他4 个萃取头，65 μm DVB/PDMS萃取头与75 μm CAR/PDMS萃取头均适于萃取双极性挥发性物质，对低沸点物质萃取能力较强；100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取效果较接近，均弱于前2 种但又优于85 μm PA萃取头；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头虽然多用于萃取双极性挥发性及半挥发性物质，85 μm PA萃取头多用于萃取极性半挥发性类物质，但对烤羊肉样品挥发性组分的萃取不占明显优势。使用传统方法，即比较有效挥发性物质的整体呈现度时发现75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS萃取结果相似。但结合表2可知，二者对各挥发性物质的萃取能力差异明显，仅使用传统方法不能选择出最优萃取头。

续表2

图2 5 个萃取头萃取得到有效挥发性物质总峰面积（A）和总种类（B）Fig. 2 Total peak areas and species of effective volatile substances obtained by five SPME fibers

2.3 灵敏度检验结果

Tat等[26]认为不同萃取头对样品的挥发性物质进行萃取时，累积挥发性物质峰面积越大则表明萃取头的灵敏度越高，灵敏度的高低可能与峰的分离效果有关。由图3可知，随着保留时间的延长，不同萃取头的累积峰面积增长趋势有明显差异，根据累积峰面积的大小及增长趋势，可以将5 种萃取头按灵敏度分类。唯一在高灵敏区域的萃取头是75μm CAR/PDMS萃取头，表明该萃取头对烤羊肉样品中挥发性物质萃取能力明显优于其他4 种萃取头。

图3 不同萃取头对烤羊肉样品中挥发性成分萃取量的比较Fig. 3 Comparison of extracts of aroma components obtained by different SPME fibers

2.4 PCA结果

PCA是一种通过降维技术把多个变量化为少数几个相互独立且包含原有变量大部分信息的主成分（即综合变量）的统计分析方法[27]，不受主观因素的影响。

2.4.1 Kaiser-Meyer-Olkin（KMO）和Bartlett’s检验

KMO值越接近于1，意味着变量间的相关性越强；Bartlett’s检验根据相关系数矩阵的行列式得到，如果该值较大，且其对应的相伴概率值小于显著性水平，则原有变量越适合作因子分析。KMO检验系数大于0.5，相伴概率值小于0.05，则认为原始变量之间存在相关性，适合作PCA。

表3 KMO和Bartlett’s检验Table 3 KMO and Bartlett’s test

由表3可知，对挥发性物质（同时在至少3 个萃取条件下出现的物质）的峰面积作KMO值检验后发现系数为0.527，由Bartlett球形检验可知相伴概率值为0.000，说明5 种萃取头、77 种挥发性物质峰面积之间的相关程度较强，可进一步通过PCA研究不同涂层的萃取头与有效挥发性物质成分间的相关关系。

2.4.2 不同萃取头PCA

表4 不同萃取头之间相关性Table 4 Correlation between different SPME fibers and volatile substances

不同涂层萃取头对烤羊肉样品萃取后得到的挥发性成分峰面积比较离散，经标准化处理后进行PCA，可以对不同萃取头萃取能力的差异性及相似性进行明确评价。如表4所示，PC1和PC2分别可以解释数据总变异的42.93%和36.33%，说明PCA可反映样品的大部分信息，对数据样本进行较好阐释。由表4、图4可知，其中85 μm PA、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取能力接近，PC2均为正值，位于载荷图的上半部分；75 μm CAR/PDMS萃取头在PC1上为正值，PC2上为负值，位于第4象限；65 μm DVB/PDMS萃取头位于第3象限；5 个萃取头可被明显区分。

图4 挥发性成分与萃取头载荷图Fig. 4 Correlation between volatile components and SPME fibers

图4中不同挥发性物质聚集在不同萃取头附近，表明不同萃取头对其萃取能力有明显差异。与75 μm CAR/PDMS位于同一象限的物质有z2、z3、z4、z6、z8、z12、z18、z19、z20、z22、z23、z24、z25、z26、z27、z28、z29、z30、z31、z32、z33、z36、z38、z42、z43、z44、z46、z51、z52、z54、z57、z63、z66、z75、z76、z77；65 μm DVB/PDMS附近聚集的挥发性物质有z10、z11、z13、z14、z15、z16、z21、z35、z45、z47、z48、z49、z50、z55、z56、z58、z59、z61、z62、z65、z67、z68、z69、z71、z72、z73、z74、z77；85 μm PA、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS对z1、z5、z7、z9、z17、z34、z37、z39、z40、z41、z53、z60、z64、z70萃取能力较好。

表5 挥发性成分载荷矩阵（至少有1 个主成分值大于0.8）Table 5 Loading matrix of volatile components (with at least one principal component greater than 0.8)

因子载荷系数可以综合反映出烤羊肉中各挥发性风味物质对各主成分的影响，初始因子载荷矩阵负荷越大，则主成分对该变量的代表性越强。由表5可知，z18（1-辛烯-3-醇）、z19（庚醛）、z20（正戊醛）、z22（十二醛）、z23（反-2-癸烯醛）、z26（6-甲基庚醛）、z29（对异丙基苯甲醛）、z30（己醛）、z32（苯甲醛）、z33（辛醛）、z51（1-异丙基二甲基-2,4-氧杂环丁烷）、z53（2-甲基-3-甲硫基呋喃）、z63（1-十四炔）、z75（萘）在PC1上有大于0.80的投影，z21（癸醛）、z24（壬醛）、z35（4-甲基壬酸）、z77（联二苯）在PC2上有大于0.80的投影。这18 种物质中除了z51外（1-异丙基二甲基-2,4-氧杂环丁烷）同时被至少3 个萃取头吸附上，说明剩下的17 种挥发性物质可以初步被认为是烤羊肉样品中的共有物质。

结合图4可以发现，z18（1-辛烯-3-醇）、z19（庚醛）、z20（正戊醛）、z22（十二醛）、z23（反式-2-癸烯醛）、z26（6-甲基庚醛）、z29（对异丙基苯甲醛）、z30（己醛）、z32（苯甲醛）、z33（辛醛）、z63（1-十四炔）、z75（萘）、z77（联二苯）被75 μm CAR/PDMS萃取头吸附的强度更大，z35（4-甲基壬酸）在使用65 μm DVB/PDMS时吸附更好；z53（2-甲基-3-甲硫基呋喃）在使用85 μm PA、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头时吸附效果更好。

高温的环境发生剧烈氧化反应，一些热敏性的香气成分分解，且质构发生变化，饱和的脂肪酸会因受热降解生成一些脂肪醛、酮和醇等[28-29]。这可能是因为羊肉中较高的水分含量和烧烤初期较低的热反应温度，使得脂肪降解产物的含量占主要地位，例如脂肪酸氧化得到4-甲基壬酸、4-乙基辛酸、庚酸乙酯等脂肪酸产物及花生四烯酸热降解可能产生较高含量的1-辛烯-3-醇，而烤肉中产生的2-戊基呋喃、2-甲基-3-甲硫基呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪等则可能是在较高温度条件下与其他风味中间产物进一步发生了反应。

醇类物质主要来源于脂肪氧化，本实验主要检测到的醇类物质多为饱和醇如戊醇、辛醇、壬醇、癸醇，与不饱和醇（如2-辛炔-1-醇、1-辛烯-3-醇）相比，饱和醇的嗅觉阈值较高，对烤肉的整体风味贡献较小。其中1-辛烯-3-醇具有令人愉悦的蘑菇味、青草香，在烤肉香气中占重要地位，有学者认为1-辛烯-3-醇是在15-脂氧合酶催化二十碳五烯酸和12-脂氧合酶催化花生四烯酸的过程中形成的[30]。

醛类物质的来源主要是脂肪氧化和降解及Strecker氨基酸反应。烤肉中检测到的醛类物质主要是己醛、壬醛、苯甲醛、6-甲基庚醛、（E）-2-壬烯醛、对异丙基苯甲醛等。有研究发现，脂类在低温条件下氧化会生成大量己醛，在高温长时条件下更易氧化生成2,4-癸二烯醇。赵梦瑶等[31]认为壬醛、己醛、辛醛等是炖煮羊肉关键香气物质；Xu Yongxia等[32]研究发现（E）-2-辛烯醛会显著影响美拉德反应体系中硫醇类、杂环类物质的形成；詹萍[33]认为Z-2-癸烯醛对羊肉风味起较重要作用；苏里阳等[34]发现烤全羊冷藏复热后肉中香气品质的影响作用包括醛类物质；Grujic-jovanovic等[21]发现羊肉味是一种复杂的平衡结果，（E,E）-2,4-癸二烯醛、（E）-2-壬烯醛是烤羊肉中气味活性值最高的2 种物质。己醛是亚油酸的降解产物，可能是由羊肉中脂肪的含量较高导致，主要呈现苹果香、生油脂味。苯甲醛可能来自于苯丙氨酸的降解[35]，呈现果香、苦杏仁味，能够赋予烤肉浓厚的脂香。壬醛是油酸氧化的产物，具有水果香气。本次实验结果发现的己醛、辛醛（青果皮香、脂肪味）、庚醛（坚果味、水果香、脂肪味）、正戊醛（刺鼻味）、壬醛（玫瑰、柑橘香、强烈脂肪味）等均对烤羊肉的香气成分有重要意义。

酮类物质是脂肪氧化的另一类主要产物，这类物质可能是醇的氧化产物，也可能是酯类分解的产物。肉中除含有一定不饱和脂肪之外，含有很大比例的蛋白质，提供生成支链酸所需的氨基酸，而Strecker醛又可进一步反应生成各种短链酮。烤羊肉中主要酮类物质有[36]：2,3-辛二酮、2-甲基庚烯酮（肉味、强烈脂肪香）、3-羟基-2-丁酮（奶油香）。与醛类物质相比，酮类物质的嗅觉阈值较高，对烤肉的整体风味贡献较小。

酸类物质是由醛酮氧化或脂肪酸降解产生，能够有效地修饰风味。Rota[37]研究发现4-乙基辛酸是炖煮羊肉中关键酸类物质。4-乙基辛酸主要表现出干酪味、煮羊肉味，4-甲基壬酸呈现出羊脂味、烤羊肉香。实验中发现的4-乙基辛酸、4-甲基壬酸可共同构成烤羊肉特殊香气。

含硫、含氮及杂环类化合物是肉品最重要的风味物质，其主要来源于美拉德反应、氨基酸及硫胺素的热降解。它们普遍具有坚果、咖啡或烤肉样的烤味香型，在烤羊肉中发现香气强度突出的组分是萘、2-戊基呋喃、2-甲基-3-甲硫基呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪等物质。2-戊基呋喃主要呈现清香、泥土味，2-甲基-3-甲硫基呋喃呈现烤花生、胡椒香气，2,3,5,6-四甲基吡嗪呈现烤香、肉香。

另外，在烤肉样品中还检测到各种嗅觉阈值相对较高的脂肪烃类物质，这些物质对烤肉的整体风味贡献较小。（E）-4-十二烯、1-十二炔、1-十二烯、1-十三炔、1-十四炔等物质，它们主要来自脂类热氧化降解反应。

结合PCA结果，样品中的关键香气成分1-辛烯-3-醇、庚醛、正戊醛、十二醛、反式-2-癸烯醛、己醛、苯甲醛、1-十四炔、萘、4-甲基壬酸等更多地集中于75 μm CAR/PDMS萃取头，故而可进一步选择75 μm CAR/PDMS萃取头为萃取烤羊肉样品中关键挥发性物质的最优萃取头。

3 结 论

采用5 种常用的SPME涂层萃取头（100 μm PDMS、85 μm PA、75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）对烤羊肉有效挥发物的提取性能进行比较研究。结果表明，75 μm CAR/PDMS、65 μm DVB/PDMS萃取头萃取得到的物质峰面积及峰个数最接近，这2 种萃取头仅通过比较挥发性物质整体呈现度的方法，难以进行有效区分并选出最适宜用于萃取烤羊肉挥发性物质的萃取头；经过萃取头灵敏度检验后发现75 μm CAR/PDMS萃取头对样品中挥发性物质有着萃取灵敏性高且显著优于其他萃取头的优点；通过PCA法比较挥发性成分在萃取头附近的聚集情况并挑选出载荷矩阵中投影大于0.80的共有物质，发现1-辛烯-3-醇、庚醛、正戊醛、十二醛、反-4-癸烯醛、6-甲基庚醛、对异丙基苯甲醛、癸醛、壬醛、己醛、苯甲醛、4-甲基壬酸、辛醛、2-甲基-3-甲硫基呋喃、1-十四炔、萘、联二苯为烤羊肉中关键香气成分，可见75 μm CAR/PDMS萃取头对关键香气物质的识别有明显优势。本实验思路亦可以在其他基于GC-MS与SPME的实验时，为条件选择与优化提供借鉴。

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