响应面法优化酶解藜麦糠蛋白制备抗氧化肽工艺

田旭静，段鹏慧，范三红,*，张婧婷

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西林业职业技术学院，山西 太原 030009）

自由基是机体在正常代谢过程中产生的有害化合物，具有高度氧化性。体内过多的自由基会引起蛋白质损伤、脂质过氧化、核酸损伤，人体亚细胞水平上的氧化诱发一些疾病的发生，如高血压、肝硬化、糖尿病、老年痴呆症和癌症等[1-3]。抗氧化肽是能有效清除体内活性氧自由基的一种生物活性肽。它具有分子质量小、稳定性高、活性强和易吸收等特点[3]。抗氧化肽通过清除体内过剩的自由基、抑制脂质过氧化反应、鳌合金属离子、提供氢质子[4]等实现抗氧化目的，从而保护线粒体和细胞结构，维持其正常功能。多肽抗氧化性的强弱可以通过还原能力和体外清除自由基能力的大小来表示。目前一些化学合成的抗氧化剂对人体存在一定的毒副作用，危害人体健康，因此安全健康高效的天然抗氧化剂的开发成为研究热点[5-6]。运用酶解法可以使抗氧化活性肽从蛋白质中释放出来，此方法得到的多肽抗氧化活性强，安全无毒，在医学、化妆品、功能食品和食品配料等方面有广阔的研究前景[7]。

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）为原产于南美洲的藜科（Chenopodiaceae）假谷物，是一种一年生草本植物，从20世纪80年代开始，我国引入藜麦，近几年呈现规模化种植[8]。藜麦含有丰富的易被人体吸收的优质蛋白质，并且其氨基酸比例平衡，能够满足人体基本营养需求[9-11]。藜麦糠作为藜麦加工后的副产品，其蛋白质含量较高，一般都被简单处理后作为动物饲料，造成资源浪费，没有得到有效利用[12]。酶解藜麦糠蛋白可以得到具有一定功能的抗氧化肽，同时提高了藜麦糠的附加值，实现进一步综合利用[13]。

本研究以藜麦糠蛋白为原料，以还原能力为控制指标，筛选出适合藜麦糠酶解的蛋白酶，通过单因素试验和响应面分析优化了藜麦糠蛋白酶解的最佳工艺条件，并对藜麦糠抗氧化肽的自由基清除能力进行研究，为实现藜麦糠产品的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦糠蛋白（总蛋白质量分数87.3%）由实验室自制。

中性蛋白酶（酶活力6.0×104U/g）、胰蛋白酶（酶活力2.5×105U/g）、碱性蛋白酶（酶活力2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力6.0×106U/g）、风味蛋白酶（酶活力2.0×104U/g）、复合蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、铁氰化钾、甲醛、三氯化铁、三氯乙酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-W恒温水浴箱 恒丰仪器制造有限公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；SP-200OUV型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TDL-5离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 藜麦糠抗氧化肽制备工艺流程

质量分数5%的蛋白液→沸水浴10 min→不同酶解条件→沸水浴灭酶15 min→冷却→离心（4 000 r/min，10 min）→收集上清液（测定还原能力和水解度）→贮藏备用

1.3.2 水解度的测定

总氮的测定采用凯氏定氮法[14]。游离氨基氮测定采用甲醛滴定法[15]。水解度计算如下式所示：

1.3.3 抗氧化活性的测定

1.3.3.1 还原能力的测定

取0.1 mL藜麦糠酶解液加入试管中，将0.2 mol/L PBS溶液（pH 6.6）和2%的铁氰化钾溶液各加入2.5 mL，在50 ℃水浴中反应20 min，再加2.5 mL 10%的三氯乙酸，摇匀后，5 000 r/min离心10 min。吸取2.5 mL上清液于试管中，将0.5 mL 0.1%三氯化铁和2.5 mL蒸馏水依次加入其中，放置10 min后，样品在700 nm波长处进行吸光度的测定。以样品的吸光度表示其抗氧化肽的还原能力，吸光度变大，还原能力增强[16]。

1.3.3.2 自由基清除能力测定

羟自由基清除率测定采用水杨酸法[17]；超氧阴离子自由基清除率测定采用邻苯三酚自氧化法[18]。

1.3.4 最佳蛋白酶的选择

蛋白酶的初选：选择6种蛋白酶（包括胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）分别对藜麦糠蛋白进行初步水解。水解条件为加酶量2 000 U/g、底物质量浓度5 g/100 mL，在不同蛋白酶各自最适pH值和温度条件下（表1），酶解时间为2 h，以水解度和还原能力为评价指标，综合筛选出具有还原能力且水解度相对较高的蛋白酶，进行下一步实验。

蛋白酶的复选：准确称取5 g藜麦糠蛋白，用95 mL蒸馏水溶解配成5 g/100 mL质量浓度的蛋白液，单酶及复合酶（各复合酶比例为1∶1）加酶量均为2 000 U/g，在各酶最适pH值和温度条件下（表1），酶解2 h，通过比较还原能力大小，筛选出最佳的单酶或复合酶。

1.3.5 酶解单因素试验

固定底物质量浓度5 g/100 mL、加酶量4 000 U/g、酶解时间2 h、pH 7.5、酶解温度50 ℃为单因素试验条件，以还原能力和水解度为复合酶的测定指标，进一步考察加酶量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g），酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），pH值（5.5、6.5、7.5、8.5、9.5），酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）对酶解效果的影响。

1.3.6 响应面试验

根据单因素试验结果，以pH值、加酶量、酶解温度和酶解时间4 个因素为自变量，还原能力为响应值，采用响应面法设计4因素3水平试验进行优化，按照Box-Behnken原理进行试验设计[19-20]，试验因素及水平见表2。

表2 藜麦糠蛋白酶解工艺优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and their coded values used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 最佳复合酶的确定

2.1.1 蛋白酶的初选

表3 不同种类蛋白酶作用下抗氧化肽的评价指标Table 3 Effect of different proteases on reducing powder and degree of hydrolysis

由表3可知，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶相对于其他3 种酶水解度和还原能力均偏低，所以综合考虑两方面因素，选择胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶进行下一步复选实验。

2.1.2 蛋白酶的复选

比较各个单酶及复合酶的还原能力，由图1可知，当风味蛋白酶与碱性蛋白酶以1∶1比例组合时，吸光度最大，为0.833，即还原能力最强。而其他组合酶与单酶加入时，还原能力降低，所以选取风味酶和碱性酶1∶1比例组成的复合酶来酶解藜麦糠蛋白效果最佳。

图1 不同蛋白酶对藜麦糠酶解液还原能力的影响Fig. 1 Effects of different protease combinations on reducing power

2.2 单因素试验结果

2.2.1 加酶量对酶解效果的影响

在底物质量浓度为5 g/100 mL时，选定复合酶在pH 7.5和50 ℃条件下酶解2 h，考察不同加酶量对酶解液还原能力和水解度的影响，如图2所示。

图2 加酶量对酶解液还原能力和水解度的影响Fig. 2 Effects of enzyme dosage on reducing power and degree of hydrolysis

由图2可知，随着加酶量的增大，酶解液的还原能力和水解度逐渐上升，这是因为在底物质量浓度一定时，增大加酶量，使得酶与蛋白质分子接触机会增多[21]，底物蛋白水解越充分，生成的小肽量越多，水解度和酶解多肽还原能力自然随之上升。当加酶量继续增至3 000 U/g时，逐渐表现出底物不足的现象，水解度的增加开始变得缓慢，但大分子的多肽还可以被进一步降解成具有抗氧化活性的小分子多肽，所以还原能力继续上升。当加酶量增至4 000 U/g时，吸光度达到最大值0.528，此时还原能力最强。随着加酶量进一步增加，就会出现小分子的抗氧化肽被降解，其还原能力开始下降[12]。因此，加酶量在4 000 U/g左右为最佳[22]。

2.2.2 pH值对酶解效果的影响

在底物质量浓度为5 g/100 mL时，选定复合酶在加酶量4 000 U/g和50 ℃条件下酶解2 h，考察pH值对酶解液还原能力和水解度的影响，如图3所示。

图3 pH值对酶解液还原能力和水解度的影响Fig. 3 Effect of pH on reducing power and degree of hydrolysis

pH值的改变，即改变溶液中H+离子浓度不仅会影响蛋白酶活性中心相关基团的解离状态，也影响底物和辅酶的解离程度，进而影响酶解反应[22]。由图3可知，在pH 5.5～7.5之间还原能力和水解度不断增加，到7.5时均达到最大，之后逐渐降低，由于过酸或过碱会破坏酶的空间结构，使酶活力减弱甚至失活，pH值在适宜范围内才可以发挥较佳的酶解效果。因此选定复合酶的最佳pH 7.5，在此条件下酶解能够顺利进行[23]。

2.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

在底物质量浓度为5 g/100 mL时，选定复合酶在加酶量4 000 U/g和pH 7.5条件下酶解，温度为50 ℃，考察酶解时间对酶解液还原能力和水解度的影响，如图4所示。

图4 酶解时间对酶解液还原能力和水解度的影响Fig. 4 Effect of hydrolysis time on reducing power and degree of hydrolysis

在酶解开始的一段时间，酶解液的还原能力和水解度逐渐升高，当酶解时间达到2.0 h时，还原能力最大值为0.533，之后有所降低。呈现一种先升高后下降的趋势。而水解度在2.0 h后增加变得缓慢。出现这种趋势可能因为酶解刚开始，底物和酶质量浓度均比较高，两分子接触面积较大，酶解速度较快，因此水解度增加幅度较大，同时迅速水解释放出一些具有还原性的肽端[24]。表现为水解度和还原能力都升高。随着反应进行，酶量减少，酶活力下降，酶解液中游离肽的不断积累增加了对产物的抑制，水解度的增加趋势逐渐平缓[25]。而一部分具有抗氧化性的肽端被水解成更小的片段，甚至过度水解，使酶解液中游离的氨基酸含量增加，酶解液的还原能力大幅度降低[24]。因此，选取酶解时间为2.0 h左右为宜。

2.2.4 酶解温度对酶解效果的影响

在底物质量浓度为5 g/100 mL时，选定复合酶在加酶量4 000 U/g和pH 7.5条件下酶解2 h，考察酶解温度对酶解液还原能力和水解度的影响，如图5所示。

图5 酶解温度对酶解液还原能力和水解度的影响Fig. 5 Effects of hydrolysis temperature on reducing power and degree of hydrolysis

由图5可以看出，酶解温度在50 ℃以内，反应温度上升，酶活性增加，同时酶解速度加快，水解度增加的同时，还原能力也升高，在50 ℃时，水解度最高达到13.81%，还原能力也达到最高。温度超过50 ℃，可能会改变酶的空间结构，蛋白酶逐渐变性而丧失催化活性。水解度和还原能力均降低，因此，复合酶最佳酶解温度应在50 ℃左右[26]。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计及结果

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Response surface design with experimental results

响应面试验结果见表4，采用Design-Expert 8.0.6软件对表4试验数据进行方差分析，结果见表5。

表5 回归方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

通过响应面方差分析得到藜麦糠抗氧化肽还原能力的二次多项回归方程为：Y=0.63－0.011A＋9.167×10－4B＋0.023C＋6.167×10－3D－6.750×10－3AB－1.500×10－3AC＋7.500×10－4AD＋0.014BC＋4.500×10－3BD＋5.250×10－3CD－0.014A2－0.024B2－0.051C2－0.037D2。

从表5可看出，模型P值小于0.000 1，表示该回归模型高度显著；失拟项P值为0.764 5，不显著，说明该回归模型预测值与实测值有较好的拟合水平，所选模型适宜。回归系数R2为0.995 2，表明该模型相关度好[13]。值为0.990 3，表明有99.03%的响应值变化可以用模型来解释，模型具有良好的拟合度，试验误差较小，可以对试验结果进行准确分析和预测[27]。回归方程各项的方差分析表明，A、C、D、AB、BC、CD、A2、B2、C2、D2均达到极显著水平。回归方程一次项系数绝对值的大小，决定了各因素对响应值影响的主次顺序为酶解时间、加酶量、酶解温度、pH值[28]。

2.3.2 响应面分析与条件优化

图6 各因素交互作用对藜麦糠酶解液还原能力影响的响应面和等高线图Fig. 6 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of hydrolysis conditions on reducing power

由图6a可知，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，当加酶量较少时，还原能力随pH值的升高先急剧升高后缓慢下降，当加酶量较多时，还原能力随pH值的升高无明显变化；当pH值较小时，还原能力随加酶量的增加先升高后下降，上升与下降幅度变化不明显，当pH值处于7.5～8.0之间，固定pH值，加酶量不断增加，还原能力先缓慢升高后急剧下降。pH值和加酶量的交互作用对响应值影响极显著[27]。

由图6b可知，加酶量4 000 U/g，酶解温度50 ℃，当pH值在6.5～7.5之间，固定pH值，还原能力随着酶解时间的延长先升高后下降，上升和下降幅度都很明显；当pH值高于7.5后，随着酶解时间的延长，还原能力先迅速升高后缓慢下降，且升高幅度很明显；当酶解时间较短时，pH值的增大对还原能力影响不大，酶解时间在2.1 h时，还原能力随pH值的增大上升幅度逐渐变小，达到最大后稍有下降，但下降幅度不明显。pH值和酶解时间的交互作用对响应值影响极其显著[27]。

由图6c可知，pH 7.5，加酶量4 000 U/g，当酶解时间较短时，酶解温度的升高对还原能力影响不大，整体变化幅度不明显；当酶解时间在2.1～2.2 h时，酶解温度在45～51 ℃之间，还原能力随着酶解温度的升高逐渐上升并且趋于平稳[27]，酶解温度51 ℃之后，还原能力随温度升高略微下降；当酶解温度水平较低和较高时，还原能力随着酶解时间的延长先快速升高后下降，升高幅度明显。酶解温度和酶解时间的交互作用对响应值影响较为显著[29]。

等高线的形状不同，交互效应的强弱也不同。交互项的等高线图越近似椭圆形，表明交互作用越强[30]。由图6的等高线图可以看出，3 组交互作用中，pH值和酶解时间的交互作用最强，其次是加酶量和pH值的交互作用，而酶解时间和酶解温度的交互作用最弱，这与表4显著性检验结果完全符合。由响应面图可知，响应面的最高点为该模型在所选范围内的最大值[28]。

Design-Expert 8.0.6软件对试验的优化结果为加酶量3 600 U/g、pH 7.66、酶解时间2.13 h、酶解温度50.53 ℃，预测模型的还原能力为0.636 5。结合实际操作情况，将各酶解条件修正为加酶量3 600 U/g、pH 7.7、酶解时间2.1 h、酶解温度50 ℃，在此条件下进行3 次实验，得到的结果分别为0.642、0.631和0.659，计算平均值为0.644，与预测值0.636 5接近，说明建立的模型可以更好地预测藜麦糠抗氧化肽的还原能力[24]。在此还原能力下，抗氧化肽的得率为76.25%。

2.4 藜麦糠抗氧化肽对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力

藜麦糠抗氧化肽含有丰富的供氢体，氢质子可以用来还原活性氧自由基，通过终止自由基链式反应，使自由基得到清除。

图7 藜麦糠抗氧化肽用量对超氧阴离子和羟自由基的清除能力Fig. 7 Superoxide anion and hydroxyl radical scavenging capacity of antioxidant peptides at different dosages

从图7可以看出，当抗氧化肽质量浓度为30 mg/mL时，藜麦糠抗氧化肽对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力均随着抗氧化肽体积的增加而上升，存在较好的量效关系。在一定用量范围内，抗氧化肽对超氧阴离子自由基的清除率均高于羟自由基，而且上升幅度比较明显。抗氧化活性强这一特性，使藜麦糠抗氧化肽有望更好地被应用到天然抗氧化剂和功能性食品领域，进而研究开发，实现利用价值[17]。

3 讨论与结论

以藜麦糠蛋白为原料，首先确定酶解藜麦糠蛋白的最佳复合酶组合，然后通过响应面试验对酶解工艺条件进行优化，从优化的结果来看，温度和pH值符合酶的特性，优化结果中酶解时间2.1 h比较适中，说明获得抗氧化肽并不需要太长的酶解时间，表明酶解时间如果过长一部分具有抗氧化性的肽端会被水解成更小的片段甚至氨基酸，从而致使酶解液的抗氧化性降低[13]。温建丰等[13]对花蟹肉酶解制备抗氧化肽的工艺进行了优化，其最优参数为用碱性蛋白酶在51 ℃、pH7.5的条件下酶解3.2 h；冯小敏等[23]选用风味蛋白酶与中性蛋白酶1∶1比例组合的复合酶酶解虾头，最佳条件为在54 ℃、pH 7.4的条件下酶解3.9 h。以上研究虽采用不同蛋白酶来酶解不同原料蛋白，但最佳酶解温度和pH值都与本研究较接近，说明酶解不同蛋白制备抗氧化肽存在一定的相似性。为了提高抗氧化肽的纯度，使其抗氧化性更好，本实验需要进行深入研究，具体包括以下内容：运用超滤技术分离纯化酶解产物；对纯化前后多肽的抗氧化性比较；分析不同分子质量多肽的抗氧化性。

通过比较不同蛋白酶对藜麦糠蛋白的酶解效果，得出选用风味蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1比例组合对藜麦糠蛋白进行酶解时，酶解液还原能力最高。根据单因素试验结果，采用响应面分析法对藜麦糠蛋白酶解工艺进行优化，得到优化组合条件为加酶量3 600 U/g、pH 7.66、酶解时间2.13 h、酶解温度50.53 ℃，在此条件下验证实验，还原能力为0.644。在此还原能力下，抗氧化肽的得率为76.25%。藜麦糠抗氧化肽对超氧阴离子自由基和羟自由基有很强的清除能力，并符合一定的量效关系，为藜麦糠的进一步深加工利用提供了理论支持。

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