内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下黑麦草种子萌发的影响

刘 静，周景乐，陈振江，魏学凯，李 涛，李春杰

(草地农业生态系统国家重点实验室，农业部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

多年生黑麦草(Loliumperenne)为禾本科黑麦草属植物，分蘖能力强，成坪速度快，适应土壤范围广，耐寒耐践踏，常作为建植草地的先锋草种[1]。作为草坪草，黑麦草已被广泛种植，但其喜温暖湿润的环境，抗旱性差[2]，因此，对多年生黑麦草抗旱性的研究具有重要意义。

内生真菌是指在其生活史的部分或全部阶段生活于植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的真菌[3]。研究表明，禾草-内生真菌共生体稳定的互利共生关系不仅保证了内生真菌所需的全部营养物质，而且共生体产生的次生代谢物可显著提高宿主禾草对病害[4-5]、虫害[6]等生物胁迫抗性和抗寒[7]、耐盐[8]等非生物胁迫抗性。目前，国际上对禾草内生真菌共生体在干旱胁迫下对种子的萌发及幼苗生理特性的研究主要集中在高羊茅[9-10](Festucaarundinacea)和多年生黑麦草[11-12](Loliumperenne)等植物上。研究表明内生真菌侵染能够增加高羊茅的根生物量、根系数量、根长和根直径，而这些特征能够增加根部吸收水分的表面积[13]，在多年生黑麦草中也有相同的变化趋势[14]。但是离体条件下，内生真菌发酵液浸种对种子的萌发及幼苗生理特性影响的研究报道较少。钟松等[15]研究发现，不同浓度的中华羊茅(Festucasinensis)内生真菌发酵液对醉马草(Achnatheruminebrians)种子的发芽势、发芽率、苗长、根长、苗鲜质量等指标起到不同程度的抑制或促进作用。王维[16]发现,PI-Z02发酵液对萝卜(Raphanussativus)和油菜(Brassicanapus)的发芽有明显的促生作用。

干旱是影响植物生长的主要非生物胁迫因素之一[17]。种子在发芽阶段的耐旱状况，在一定程度上反应了该种子的耐旱程度[18]。在西北地区，水分不足很大程度上影响了草坪草的种植和推广。因此，对黑麦草种子萌发进行抗旱性研究具有极其重要的意义。PEG模拟干旱胁迫对种子抗旱性进行研究是目前研究的热点,其具有操作简单，可重复性强等优点[19]。虽然我国对禾草内生真菌研究起步比较晚，但关于禾草内生真菌共生体抗旱性的研究已经有了大量的报到，陈志豪等[20]发现高羊茅种子萌发时，用PEG-6000模拟干旱胁迫种子，感染内生真菌的高羊茅种子发芽率和胚根长均高于非感染种子，说明内生真菌浸染能够提高高羊茅种子萌发时的耐旱能力。任安芝等[21]就内生真菌侵染对黑麦草种子萌发、幼苗生长及渗透胁迫抗性进行了研究，发现在胁迫条件下，被真菌侵染种子的发芽势及发芽率均明显高于未侵染的种子。李飞[22]研究发现，在干旱地区，内生真菌侵染促进了醉马草种子的生长；在较重度渗透胁迫条件下，醉马草E+植株的发芽率、发芽指数、胚芽和胚根长显著高于E-植株。宋梅玲等[23]在模拟干旱胁迫条件下发现，-1.2～-0.6 MPa时, E+的发芽率和发芽指数显著高于E- (P<0.05)，E+的胚根长、胚芽长和幼苗含水量也显著大于E-(P<0.05)。但是离体条件下生物胁迫和非生物胁迫的互作对多年生黑麦草种子萌发的影响研究较少。

本研究以不带内生真菌的黑麦草为研究对象，用醉马草、披碱草(Elymusdahuricus)、中华羊茅3种禾草内生真菌发酵液对黑麦草种子进行浸种，旨在探索不同浓度PEG胁迫下内生真菌在离体状态下对多年生黑麦草种子萌发的影响，为内生真菌在离体状态下对植物抗逆性的影响提供理论依据。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

种子：多年生黑麦草品种为顶峰(Pinnacle)，由兰州大学草地农业科技学院提供[24]。采收种子5 ℃下保存于农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心(兰州)贮藏室，备用。

菌株：分离于醉马草的甘肃内生真菌(Epichlo⊇gansuensis)；分离于披碱草的雀麦内生真菌(E.bromicola)；分离于中华羊茅的内生真菌(Epichlo⊇ sp.)；均由兰州大学草地农业科技学院提供。

培养基：培养基纯化菌株采用PDA培养基，配方为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL。摇瓶种子培养基采用M102[25]，配方为蔗糖30 g，麦芽糖20 g，酵母膏1.0 g，蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1发酵液的制备 挑取斜面试管菌种的菌丝转接至平板PDA培养基上，22 ℃黑暗培养4周。4周后，用无菌打孔器在菌落边缘切取3块6 mm的菌碟，尽量切碎，转入含50 mL/250 mL M102液体培养基的三角烧瓶中，22 ℃摇床培养箱内黑暗，120 r·min-1条件下持续培养4周，离心后吸取上清液即为内生真菌发酵液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2种子处理 挑选大小一致、籽粒饱满的(E-)多年生黑麦草种子，将种子浸泡在发酵液(醉马草、披碱草、中华羊茅)中，以空白液体培养基中加蒸馏水浸种为对照，置于摇床以120 r·min-1震荡培养6 h[26]。

1.2.3PEG-6000 胁迫液配制 采用不同质量浓度的聚乙二醇(PEG)溶液，形成不同的干旱条件。依据参考文献[27-28]的PEG-6000溶液配制公式，配成0(对照)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa(分别相当于0、12.5%、17.6%、21.1%、23.9%的PEG-6000溶液)5个水势梯度模拟干旱条件。

1.2.4发芽的基本条件 发芽试验参照GB2930-82《牧草种子检验规程》。干旱胁迫试验采用纸上发芽(TP)法，将发酵液处理后的种子摆放到底部垫有两层滤纸(分别加入5 mL 0、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa的PEG-6000胁迫溶液)培养皿中，滤纸和培养皿均高温灭菌，置于22 ℃培养箱中黑暗培养。各处理均为4个重复，每个重复50粒种子，发芽期为16 d。每天统计发芽数，7 d时统计发芽势，16 d后每个处理中随机选取10株幼苗，测定并记录其根长和苗长及鲜重和干重，并计算发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗含水量、率霉变。

指标计算方法：

发芽率=(正常发芽种子数/供试种子数)×100%；

种子发芽势=(发芽数达高峰的前1/3天数内正常发芽种子数/供试种数)×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)。

式中：Gt指t时间内的发芽数，Dt指相应的发芽日数。

活力指数=GI×SX。

式中：GI指发芽指数，SX指种苗芽的平均长度。

幼苗含水量=(幼苗单株鲜重)-(幼苗单株干重)；

发霉数=(发霉种子数/供试种子数)×100%。

1.3 数据处理方法

采用SPSS 19.0软件对所测数据统计分析，用平均值±标准误表示测定结果，分别对同一发酵液浸种下不同处理、同一处理不同发酵液浸种下多年生黑麦草种子的发芽率、发芽指数、根长和幼苗长等各项指标进行单因素方差分析。采用Microsoft Excle 2013录入数据并作图。

2 结果与分析

2.1 内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下种子萌发的影响

随着PEG浓度的增加，各处理下黑麦草种子的发芽率均呈下降趋势；不同发酵液浸种与对照的发芽率相比较差异显著(P<0.05)；在-0.6～0 MPa间，不同发酵液浸种种子的发芽率差异不显著(P>0.05)，但-0.9 MPa下，醉马草发酵液浸种种子的发芽率显著(P<0.05)大于其他处理；在-1.2 MPa下，黑麦草种子不萌发(图1)。

随着PEG浓度的增加，对照、披碱草和中华羊茅发酵液浸种处理下黑麦草种子的发芽势呈下降趋势，而醉马草发酵液浸种下种子发芽势先增大后减小，且各处理下不同浓度之间发芽势差异显著(P<0.05)；3种发酵液浸种下种子发芽势在0和-0.3 MPa时大于对照，-0.6 MPa时则相反；除-0.3 MPa外不同发酵液浸种与对照的发芽势相比较差异显著(P<0.05)(图2)。

随着PEG浓度的增加，各处理下黑麦草种子的发芽指数均呈下降趋势，且不同浓度之间发芽指数差异显著(P<0.05)；在各PEG浓度下，醉马草发酵液浸种下种子发芽指数大于对照，在-0.6和-0.9 MPa下，披碱草和中华羊茅发酵液浸种下种子发芽指数小于对照；3种发酵液浸种下种子发芽势在0 MPa时差异不显著(P>0.05)(图3)。

随着PEG浓度的增加，黑麦草种子的活力指数均呈下降趋势，且不同浓度之间活力指数差异显著(P<0.05)；不同发酵液浸种下种子活力指数在0 MPa均小于对照，而在-0.3 MPa下则反之；在-0.6～-0.9 MPa下，醉马草发酵液浸种的种子活力指数显著大对照，披碱草和中华羊茅却反之；醉马草发酵液浸种下种子活力指数在-0.3～-0.9 MPa均为最大值，披碱草和中华羊茅发酵液浸种下种子活力指数次之，且差异不显著(P>0.05)(图4)。

图1 不同发酵液浸种对黑麦草种子发芽率的影响Fig. 1 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the germination rate in perennial ryegrass seed

不同大写字母表示相同渗透势不同发酵液浸种处理间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示相同发酵液不同渗透势处理间差异显著(P<0.05)；下同。

Different capital letters indicate significant differences among different fermentation broth soaking seed treatments with the same osmotic potential at the 0.05 level; and different lowercase letters indicate significant differences among different osmotic potentials in the same fermentation broth soaking seed treatment at the 0.05 level; similarly for the following figures.

图2 不同发酵液浸种对黑麦草种子发芽势的影响Fig. 2 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the germination force inperennial ryegrass seed

2.2 内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下种子霉变的影响

黑麦草种子的霉变率随着PEG浓度的增加先增大后减小，不同发酵液浸种下种子霉变率在-0.6 MPa下均达到最大值，对照在-0.9 MPa下达到最大值；醉马草和披碱草内生真菌发酵液浸种下种子发霉率显著小于对照(P<0.05)，而中华羊茅浸种下种子发霉率与对照差异不显著(P>0.05)；浸种处理下种子霉变率最低达到6.6%，对照下种子霉变率最低,为28.3%(图5)。

2.3 内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下幼苗及根的影响

2.3.1内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下幼苗含水量的影响 幼苗含水量随着PEG浓度的增加而减小，不同真菌发酵液浸种下幼苗含水量从大到小依次为醉马草、披碱草、中华羊茅、对照；醉马草和披碱草发酵液浸种下幼苗含水量差异不显著(P>0.05)，显著高于对照(P<0.05)(图6)。

图3 不同发酵液浸种对黑麦草种子发芽指数的影响Fig. 3 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the germination index in perennial ryegrass seedd

图4 不同发酵液浸种对黑麦草种子活力指数的影响Fig. 4 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the vigor index in perennial ryegrass seed

图5 不同发酵液浸种对黑麦草种子霉变率的影响Fig. 5 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the seed mildew rate in perennial ryegrass

图6 不同发酵液浸种对黑麦草幼苗含水量的影响Fig. 6 Effects of seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on the seedling water content in perennial ryegrass

2.3.2内生真菌发酵液浸种对干旱胁迫下幼苗长和根长的影响 不同发酵液浸种下黑麦草幼苗长随着PEG浓度的增加而减小，不同浓度下幼苗长度差异显著(P<0.05)；在0 MPa下，不同幼苗长度相差不显著(P>0.05)；不同发酵液浸种下幼苗长在-0.9～-0.3 MPa均大于对照；醉马草和披碱草发酵液浸种下幼苗长度彼此差异不显著(P>0.05)，且显著(P<0.05)大于对照(表1)。

随着PEG浓度的增加，在披碱草、中华羊茅、对照浸种下黑麦草根长先增大后减小，在-0.6 MPa下达到最大值，且在-0.3和-0.6 MPa间根长差异不显著(P>0.05)；醉马草发酵液浸种下根长随着PEG浓度的增加而增加，在0 MPa下，其根长显著(P>0.05)小于披碱草和中华羊茅处理，但在-0.6和-0.9 MPa显著大于其他浸种处理(表1)。

表1 不同发酵液预处理对黑麦草幼苗苗长、根长的影响Table 1 Effect of different seed soaking with Epichlo⊇ endophyte fermentation broth on seeding length and root lengthof perennial ryegrass

3 讨论与结论

在干旱和半干旱地区，水分是影响种子萌发的主要因子，PEG-6000因本身不易自由通过植物细胞壁，不易渗入活细胞内，不会给种子内增加营养物质，且无毒，但能减缓萌发初期水分进出种子的速率等[29]。研究发现，随着PEG浓度的增加，黑麦草种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗长和幼苗含水量均减小，此结果与Radhakrishnan等[26]不同温度和PEG处理对中华羊茅种子萌发的影响和李会强[1]等于干旱条件下内生真菌对多年生黑麦草生长影响的研究结果一致。在水分亏缺的条件下，具发达根系的植株更易存活，因为更深更密的根系能够提高植株对水分的吸收能力[30]，本研究表明，随着PEG浓度的增加，不同发酵液处理下黑麦草根系长度均在-0.6 MPa下达到最大值，说明水分的变化对可以影响植物的生长特性，而植物可以通过调节自身外部形态变化来适应干旱条件。

化感作用是指植物或微生物通过向环境中释放某些化学物质或者次生代谢产物从而对其他植物或微生物产生有利或不利的影响[31]，内生真菌发酵液则通过化感效应来影响植物的生长发育。钟松等[15]采用纸上发芽法(TP)测定中华羊茅内生真菌发酵液对中华羊茅种子萌发的影响，结果表明40倍稀释液可明显提高中华羊茅种子发芽势、发芽率，促进幼苗的生长(P<0.05)，10倍稀释液能明显增加其苗鲜质量(P<0.05)。张树武等[32]发现不同稀释倍数深绿木霉发酵液能够显著提高黑麦草种子的发芽率、发芽指数和活力指数，尤其是100倍稀释液对黑麦草种子发芽率、发芽指数和活力指数的影响较明显。蜜环菌的代谢产物对油菜籽的萌发及幼苗的生长存在明显的化感作用，这种作用对油菜的生长产生了显著的影响。发酵液在油菜籽萌发过程中对种子的发芽势影响显著，对最终种子发芽率影响不大，可促进幼苗伸长[33]。本研究表明，在内生真菌发酵液浸种下，发芽率、发芽指数、活力指数、幼苗长、根系和幼苗含水量均显著大于对照(P<0.05)，表明内生真菌的存在可以使黑麦草种子发芽能力在干旱条件下具有优势，以保证黑麦草在逆境中的生长，证明内生真菌通过促进幼苗根系的生长进而提高黑麦草幼苗含水量，使其在干旱环境下将更多的水分用于幼苗的生长，从而提高了黑麦草的抗旱性。而李绍锋等[34]首次发现豚草(Ambrosiaartemisifolia)种子中含有丰富的内生真菌，并且供试的7种内生真菌菌株的发酵液均不同程度地抑制豚草种子发芽，降低幼苗地上部高度、根长度、根数量和总生物量，并且不同菌株发酵液之间抑制程度差异明显。说明内生真菌发酵液只是通过间接的作用调控植物的生长，不同的内生真菌产生次生代谢产物不同，因此对宿主与非宿主植物影响不同，而其机理尚不十分明确。在无水分胁迫时，各处理黑麦草种子的发芽势大小依次为中华羊茅>披碱草>醉马草>对照，而在-0.3 MPa下，醉马草发酵液浸种处理种子的发芽势显著大于其他处理，且随着干旱胁迫程度的增大发芽势先增大后减小，而其他处理下发芽势均呈下降趋势，说明在种子萌发初期，中华羊茅发酵液处理比醉马草发酵液处理更易受干旱胁迫的影响，出芽整齐度大大降低。种子发生霉变的因素有好多种，一是温度过高，导致种子萌发所需要的酶失活，而后种子死亡，最后霉变；二是水分过多，氧气不足，种子无法进行有氧呼吸，产生了有害物质使种子死亡，最后发霉。但本研究引起种子霉变的主要原因是种子本身没有经过消毒处理，由于微生物的过度繁殖和种子内的种传真菌的作用，使种子发生霉变，但是霉变并没有引起种子活力的丧失。这是因为内生真菌发酵液中具有一定含量的抑菌活性物质，可有效抑制种传真菌的侵染。前人研究发现，离体培养下内生真菌具有一定的抑菌活性[35-36]。本研究发现，与对照比较，醉马草和披碱草发酵液浸种后种子霉变率降低，而中华羊茅内生真菌发酵液浸种并未有效降低黑麦草种子的霉变率，这可能是由于离体状态下中华羊茅内生真菌发酵液产生的抑菌活性物质含量较低，或者是其产生的抑菌活性物质对黑麦草种子表面的种带真菌的活性较弱导致。

综上所述，离体禾草内生真菌发酵液浸种能有效缓解干旱胁迫下黑麦草种子的萌发和幼苗生长，醉马草发酵液浸种将会更好的适应干旱环境。因此可将内生真菌发酵液制成植物保水剂等用来浸种，以提高其非生物胁迫下的萌发能力，对于离体禾草内生真菌的开发应用和田间施用具有一定指导意义。但是，内生真菌具体通过什么机理促进了种子萌发来适应干旱胁迫还有待于进一步深入研究。

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