将显微注射的蜜蜂卵培育成蜂王的方法

耿海洋 张猛 聂红毅 苏松坤

（福建农林大学 蜂学学院， 福州 350002）

近几年基因编辑技术发展迅速，特别是CRISPR/Cas9技术的出现，将基因组编辑技术带到一个新高度。它具有设计简单、特异性强、效率高等优点，这让很多普通实验室都可以运用该技术[1]。目前该技术已经成功地运用在很多模式生物中，如果蝇[2]、家蚕[3]及斑马鱼[4]等。蜜蜂是一种重要的经济昆虫，其产品及其制品在保健行业和医疗领域起着越来越重要的作用。同时蜜蜂又是植物重要的传粉者，其授粉价值和生态作用更是不可估量。CRISPR/Cas9基因编辑技术平台在蜜蜂领域中的建立，有助于揭开蜜蜂复杂社会行为与基因功能的关系，也有助于加快蜜蜂优良性状分子育种的进程，具有十分重要的现实意义。2016年，日本学者Hiroki Kohno等[5]利用CRISPR/Cas9系统在意大利蜜蜂G0代中敲除了王浆组蛋白mrjp1，但是该研究并没有在G1代中成功筛选出纯合突变体，也没有真正在蜜蜂领域中建立起CRISPR/Cas9基因编辑系统。因此，CRISPR/Cas9基因编辑系统在蜜蜂领域中的建立显得极为迫切。

蜂卵的显微注射技术是蜜蜂基因组编辑中最重要的技术之一，而将显微注射后的蜂卵培育成蜂王是基因编辑技术在蜜蜂领域中应用的不可缺少的重要环节，但是截至目前还没有用显微注射后的蜂卵培育蜂王的方法的相关报道。由于注射后的蜂卵体表还留有伤口，蜂群中的蜜蜂会将其当作异物直接清理掉，所以它不能像先前报道的移卵育王[6]直接将蜂卵转移到育王杯中。将注射后的蜂卵培育成蜂王的难点主要有4个：其一是显微注射对蜂卵的安放位置以及倾斜角度要求很高，当完成注射后，很难对蜂卵进行第二次转移，也就不能像Jakob Wegener等[7]用改造的牙钩将蜂卵转移到涂有蜂蜡的尼龙绳上进行培养；其二是刚孵化的小幼虫体色接近透明，体表有粘性很难用移虫针进行转移；其三是室内培养至孵化的小幼虫不像蜂群中孵化的小幼虫能够立刻得到内勤蜂的照顾并有新鲜的蜂王浆可供享用；其四是在给实验室内的小幼虫饲喂蜂王浆时也很容易将其淹死。因此如何将显微注射后的蜂卵培育成蜂王是困扰很多研究者的难题。

目前蜂卵的显微注射技术日渐成熟，早在1988年，Milne等人就已经摸索出一套蜂卵注射方法，每小时可以注射蜂卵100粒，同时可以达到21%的蜂卵孵化率[8]。1998年，邵瑞宜在此基础上将蜂卵的孵化率提高到35.13%[9]。2017年，本实验室已经能够将注射后蜂卵的孵化率提高到80%（数据未发表）。在蜂卵注射的基础上，本试验初步提供了几种用显微注射后的蜂卵培育蜂王的方法，并通过王台接受率对这3种方法进行比较，期望能为CRISPR/Cas9基因编辑技术在蜜蜂领域中的建立提供将注射后的蜂卵培育成蜂王的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

恒温恒湿培养箱（STIK, CTHI-150B），育王框，育王杯，移虫针，蜂王浆，注射器，培养皿，封口膜，针式囚王笼。意大利蜜蜂饲养在福建农林大学蜂学学院。

1.2 方法

1.2.1 方法A：在蜂卵孵化前（约68 h）将其转移到蜂群中的育王杯进行育王培养

具体步骤如下：① 组织育王蜂群。选取1群强群作为育王群，用毛笔蘸取新鲜的蜂王浆均匀涂在育王框上的育王杯中，然后放入继箱中部，让蜂群清理24 h。② 移虫育王。将在实验室培养箱中即将孵化的小幼虫，用移虫针转移到育王杯中。③ 割取王浆杯蜂蜡。移虫的第3天需要用刀割去王浆杯上的蜂蜡。④加囚王笼。从注射后蜂卵孵化开始算起，第10天用圆形囚王笼罩住王台。

1.2.2 方法B：蜂卵孵化后在实验室内培养12 h再转移到蜂群中的育王杯进行育王

具体步骤如下：① 组织育王蜂群。选取1群强群作为育王群，用毛笔蘸取新鲜的蜂王浆涂在育王框的育王杯中，然后放入继箱中部，让蜂群清理24 h。②收集蜂王浆。另组织蜂群收集移虫后48 h生产的蜂王浆[10]，-20℃保存。③ 饲喂蜂王浆。由于注射后的蜂卵在发育过程中会出现蜂卵孵化时间延长的现象，所以不能提前饲喂食物。在蜂卵的发育时间达到68 h左右时，用注射器将预热到34.5℃的蜂王浆食物小心地铺在正在孵化的小幼虫下方。④ 移虫育王。将在实验室培养箱中已经孵化的小幼虫，用移虫针转移到育王杯中。⑤ 割取王浆杯蜂蜡。移虫的第3天需要用刀割去王浆杯上的蜂蜡。⑥ 加囚王笼。从注射后蜂卵孵化开始算起，第10天用圆形囚王笼罩住王台。

1.2.3 方法C：蜂卵孵化后在实验室内培养12 h再通过复移方式转移到育王杯育王

具体步骤如下：① 组织育王蜂群。选取1群强群作为育王群，用毛笔蘸取新鲜的蜂王浆涂在育王框的育王杯中，然后放入继箱中部，让蜂群清理24 h。② 收集蜂王浆。另组织蜂群收集移虫后48 h生产的蜂王浆[10]，-20℃保存。③ 饲喂蜂王浆。由于注射后的蜂卵在发育过程中会出现蜂卵孵化时间延长的现象，所以不能提前饲喂食物。在蜂卵的发育时间达到68 h左右时，用注射器将预热到34.5℃的蜂王浆食物小心地铺在正在孵化的小幼虫下方。④ 移虫。选取1～2日龄左右自然状态下蜂群中的小幼虫，用移虫针转移到育王杯中。⑤ 复移育王。第2天除去未被接收的育王杯，同时移出已被接收的小幼虫。将培养箱中培养的小幼虫用移虫针转移到已被移除幼虫的育王杯中，在实验室培养箱中培养1 h后放入蜂群。⑥ 割取王浆杯蜂蜡。复移的第3天需要用刀割去王浆杯上的蜂蜡。⑦ 加囚王笼。从注射后蜂卵孵化开始算起，第10天用圆形囚王笼罩住王台。

2 结果与分析

由表1可以看出，方法C的育王效果最好，接受率达到38%；方法B次之，接受率为9.1%；方法A最低，接受率仅为1.1%。方法A直接将即将孵化的蜂卵转移到育王杯中，第2天检查发现只有1个小幼虫被接收，其余全被蜜蜂清理。原因一方面可能在于蜂卵长时间在培养箱中发育，没有蜂群的气味，所以被蜜蜂当作异物清理掉了；另一方面可能是因为转移蜂卵会造成物理上的损伤。方法B先将刚孵化的小幼虫在实验室培养箱中培养12 h，然后再转移到蜂群中育王。与方法A中转移粘立在巢础条上的蜂卵相比，方法B中的转移漂浮在蜂王浆上的小幼虫会减小对幼虫的物理伤害，而且操作起来也很便捷。方法C比方法B多了1步复移，这样做的目的是利用蜂群本身生产的蜂王浆去饲喂小幼虫，一方面可以让小幼虫接触到蜂群中的气味有利于工蜂接收，另一方面也有利于小幼虫发育成蜂王。

表1 将注射后的蜂卵培育成蜂王的3种方法比较

3 结论与讨论

本试验是在注射后蜂卵的孵化率达到80%的基础上进行的，注射后蜂卵的培养条件为温度34℃，湿度98%[5]。在蜂卵注射的基础上，我们比较了3种将注射后的蜂卵培育成蜂王的方法。在本实验中，影响蜂卵或小幼虫被接收的主要因素有2个：其一是蜂卵或小幼虫长时间在培养箱中培养，体表上已经缺少蜂群的气味信息，转移到蜂群中很容易被蜂群中的蜜蜂清理掉[11]；其二是若直接转移蜂卵或小幼虫很容易造成较大的物理伤害，因为蜂卵在孵化前后抵抗力很弱，而小幼虫的体色接近透明，粘在培养皿上很难转移。鉴于这2个因素，方法C通过先在实验室培养箱中培养12 h待其体色加深漂浮在食物上，解决了小幼虫转移的问题，然后通过复移的办法让小幼虫在蜂群自身生产的蜂王浆中培养1 h，解决了小幼虫体表上缺少蜂群气味的问题，最后达到38%的王台接受率。尽管目前蜂王的出房率还比较低，原因可能是由于该试验是在10月中旬完成的，当时的气温条件并不适合蜂王的培育[12]，所以才会有这么低的出房率，但是后期可以通过不断地优化实验条件来提高出房率。

总之，本实验给出了具体的操作方法用于指导将注射后的蜂卵培育成蜂王。期望后期将实验条件进一步优化，也期望能为CRISPR/Cas9基因编辑技术在蜜蜂领域中的建立提供技术支持。

参考文献

[1]Taning C, Van Eynde B, Yu N, et al.CRISPR/Cas9 in insects：Applications, best practices and biosafety concerns [J].J Insect Physiol, 2017, 98(1)： 245-257.

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[8]Milne C P, Phillips J P, Krell P J.Microinjection of early honeybee embryos [J].Journal of Apicultural Research, 1988,27(2)： 84-89.

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