4-氨基安替比林法快速检测异丙酚的含量

安 琪，李 莉，王婷婷，刁娟娟

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

异丙酚又名丙泊酚，为烷基酚类短效麻醉药。异丙酚是临床首选的静脉麻醉和镇静药，在国内外广泛应用于手术麻醉的诱导和维持，在体内代谢速度快[1]，个体差异较大，需要对其进行血药浓度检测，建立快速检测异丙酚的方法。目前，异丙酚的测定方法有高效液相色谱-荧光或紫外检测法[2-4]、GC法[5]、质谱法[6-8]、离子迁移谱法[9-10]、HPLC-MS法[11-12]、GC-MS法[13-14]和光纤传感法[15]等，这些方法仪器昂贵、操作复杂，且不便于进行异丙酚的快速检测。本文选择酚类物质快速检测的4-氨基安替比林法[16]对异丙酚进行衍生化后测定，能使异丙酚的检测波长红移，避免样品基质的干扰，建立检测异丙酚注射液中异丙酚含量的测定方法，该方法与《中国药典》2015年版中异丙酚含量测定的HPLC法[17]相比，差异无统计学意义。4-氨基安替比林法可用于异丙酚含量的快速检测，为其血药浓度的监测奠定研究基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 UV-2550紫外-可见分光光度计，高效液相色谱仪(LC-20AT四元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC solution 操作系统)，均购自日本岛津公司；pHSJ-3F雷磁pH计(上海图新电子科技有限公司)；AB135-S电子分析天平(天津赛多利斯天平有限公司)。

1.2试药 异丙酚对照品(质量分数为99.8%，中国食品药品检定研究院，批号100806-201402)；得普利麻异丙酚注射液(20 mL∶200 mg，阿斯利康制药有限公司，批号1205045)；乐维静异丙酚注射液(20 mL∶200 mg，四川国瑞药业有限公司，批号1211094)；丙三醇、磷酸二氢钾、氢氧化钠、无水乙醇、过氧化氢和4-氨基安替比林均为分析纯；辣根过氧化物酶(150U)、蛋黄卵磷脂为生化制剂；大豆油为药用辅料；实验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品储备液 精密称取异丙酚对照品71.40 mg(质量分数为99.8%)，加无水乙醇溶解并稀释至100 mL，得质量浓度为712.57 μg·mL-1的对照品储备液。

2.1.2供试品溶液 精密量取1.0 mL异丙酚注射液，加体积分数为40%的乙醇溶液溶解并稀释至10 mL；再精密量取200 μL，加体积分数为40%的乙醇溶液溶解并稀释至10 mL，摇匀，即得。

2.1.3磷酸盐缓冲液(pH值为7.4) 取磷酸二氢钾1.36 g，加0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液79 mL，再加水稀释至200 mL，即得。

实验用辣根过氧化物酶(HRP)溶液、过氧化氢溶液和4-氨基安替比林溶液均用磷酸盐缓冲液配制，且使用时当天配制。

2.2测定方法 依次精密量取0.5 mL过氧化氢(25 mmol·L-1)、0.5 mL异丙酚供试品、0.5 mL辣根过氧化物酶(0.5 mg·mL-1)和0.5 mL 4-氨基安替比林(20 mmol·L-1)，置于同一10 mL具塞试管中，振摇2 min，40 ℃水浴加热5 min。以体积分数为40%的乙醇为参比，于490 nm波长处用紫外-可见分光光度计测定吸光度值。

2.3检测波长的选择 4-氨基安替比林在过氧化氢和辣根过氧化物酶的催化下，与异丙酚酚羟基对位的活泼氢发生偶合反应，在一定温度下可生成橘红色化合物，对反应产物在200～800 nm范围内进行紫外-可见光谱扫描，于490 nm波长处有最大吸收，因此，选取490 nm作为检测波长。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察 精密量取2.1.1项下制备的异丙酚对照品储备液52.60 mL，用体积分数为40%的乙醇稀释至100 mL，得质量浓度为374.81 μg·mL-1的溶液；再精密量取质量浓度为374.81 μg·mL-1的异丙酚溶液0.125，0.25，0.5，1.0，1.5和2.0 mL，用体积分数为40%的乙醇稀释至100 mL，制备得到质量浓度分别为4.69，9.37，18.74，37.48，56.22和74.96 μg·mL-1的异丙酚溶液。按照2.2项下方法进行测定，以异丙酚对照品的质量浓度为横坐标(x)、吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.011x+0.024 9，相关系数r=0.998 6。结果表明，质量浓度在4.69～74.96 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.2精密度实验 取得普利麻异丙酚注射液(批号1205045)，按照2.2项下方法进行测定，连续测定6次，以质量浓度计算RSD值为0.14%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.3重复性实验 取得普利麻异丙酚注射液(批号1205045)样品6份，按照2.2项下方法进行测定，RSD值为2.67%。结果表明，该方法重复性良好。

2.4.4稳定性实验 取得普利麻异丙酚注射液(批号1205045)，按照2.1.2项下方法平行制备供试品溶液3份，按照2.2项下测定方法分别于0，15，30，45，60，90和120 min测定吸光度值，RSD值为2.13%，结果表明，样品在90 min内稳定性良好。

2.4.5加样回收率实验 取已知含量的样品(批号1205045)置于10 mL量瓶中，分别加入相当于样品中已知含量80%,100%和120%的异丙酚对照品，按照2.2项下方法进行测定，计算加样回收率，结果见表1。由表1可知，异丙酚平均加样回收率为104.05%，RSD值为3.01%。

表1 加样回收率实验结果

2.5样品测定 取得普利麻异丙酚注射液(批号1205045)和乐维静异丙酚注射液(批号1211094)，按照2.2项下方法进行测定，各批号样品平行测定3次。4-氨基安替比林法测得的得普利麻异丙酚注射液中异丙酚的平均含量为10.28 mg·mL-1，RSD值为0.50%；乐维静异丙酚注射液中异丙酚的平均含量为9.81 mg·mL-1，RSD值为0.31%。

2.6HPLC法测定异丙酚含量 采用《中国药典》2015年版中丙泊酚测定项下的HPLC法进行验证。

2.6.1色谱条件 色谱柱：VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.02 mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(pH值为3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B(日本岛津公司)，梯度洗脱，洗脱程序：0～22 min，40%B；22～38 min，40%～70%B；38～40 min，70%B；40～41 min，70%～90%B；41～45 min，90%B；45～46 min，90%～40%B。流速：1.0 mL·min-1;检测波长：275 nm;柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2.6.2测定方法 取得普利麻异丙酚注射液(批号1205045)和乐维静异丙酚注射液(批号1211094)，加无水乙醇溶解并稀释制成质量浓度为50 μg·mL-1的溶液，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。另取异丙酚对照品，同法进行测定。按照外标法以峰面积计算，即得，见表2。由表2可知，HPLC法测得的得普利麻异丙酚注射液中异丙酚的平均含量为10.24 mg·mL-1，RSD值为3.62%；乐维静异丙酚注射液中异丙酚的平均含量为9.91 mg·mL-1，RSD值为3.09%。结果表明，经配对t检验(检验水准：α=0.05)，4-氨基安替比林法与HPLC法测定异丙酚注射液中异丙酚的含量差异均无统计学意义(P>0.05)。

表22种测定方法结果的比较

Tab.2 Comparison of the result of the 2 methods

样品名称4⁃氨基安替比林法质量浓度/μg·mL-1含量/mg·mL-1平均含量/mg·mL-1RSD/%HPLC法质量浓度/μg·mL-1含量/mg·mL-1平均含量/mg·mL-1RSD/%得普利麻126．7810．3010．280．5055．1510．6110．243．62得普利麻226．5910．2353．2310．24得普利麻326．8510．3351．299．86乐维静125．589．849．810．3149．749．579．913．09乐维静225．439．7852．8110．16乐维静325．539．8251．9910．00

图1HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照品；1.异丙酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative reference substance；1.propofol.

3 讨论

3.14-氨基安替比林法空白值的影响 4-氨基安替比林为黄色固体，易吸潮分解、结块、氧化变质，会使空白值明显偏高；若4-氨基安替比林略带红色，则需加入氯仿萃取提纯后使用[18-19]。试剂要按照顺序依次加入过氧化氢、异丙酚、辣根过氧化物酶和4-氨基安替比林；若先加入4-氨基安替比林溶液会生成安替比林红使空白值偏高，影响实验结果。

3.2注射液辅料的影响 异丙酚注射液的辅料中含有大豆油、甘油和卵磷脂[20]，通过紫外-可见光谱扫描，发现这些辅料对异丙酚测定无干扰，4-氨基安替比林法适合异丙酚注射液的快速检测。

3.34-氨基安替比林法与HPLC法测定异丙酚含量的比较 本实验建立了4-氨基安替比林法测定异丙酚的含量，并将该法与《中国药典》收载的HPLC法进行比较，差异无统计学意义。HPLC法测定1个样品需50 min，而4-氨基安替比林法测定样品仅需6～8 min。综上所述，4-氨基安替比林法灵敏度高、简单易行、耗时短，为快速准确地测定异丙酚提供了新方法，为异丙酚的药物监测奠定了基础。

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