黑番茄浓缩浆HPLC指纹图谱研究及7个成分的定量分析

2018-05-18肖会敏雷美娜柴在军王四旺

西北药学杂志 2018年3期

肖会敏，雷美娜，何悦，柴在军，王四旺*

(1.空军军医大学药学院药物研究所，西安 710032；2.甘肃大漠紫光生物科技有限公司，兰州 730030)

黑番茄(Black tomato)属于被子植物门双子叶植物纲茄目茄科番茄属，原产南美洲，后经德国、美国专家研究培育成优质种籽[1]。黑番茄有“沙漠黑金刚”之称，是番茄家族的珍品，因其果色和果实均为红黑色而得名[2-3]。黑番茄含有大量的茄红素，丰富的维生素C和抗氧化物质，易被人体吸收，具有预防前列腺癌、心脏病、乳腺癌、子宫颈癌和结肠癌等功效，预防乳腺癌效果显著[4-7]。本课题前期研究证实，黑番茄对慢性前列腺炎及性机能有明显的改善作用。2003年甘肃大漠紫光生物科技有限公司与美国技术合作后，在2008年成为了继德国、美国之后全球第3个种籽生产基地，并向国内外提供鲜果生产的优质种籽，于2010年建成了全球首条黑番茄生产加工线。随着其营养价值被认知以及经济与环保价值的显现，种植范围越来越广，研究越来越多[4,8]，但到目前为止尚无黑番茄功效成分分析的报道，本研究以甘肃大漠紫光生物科技有限公司提供的黑番茄浓缩浆为实验材料，建立其指纹图谱，测定主要化学成分，为该产品的质量控制及其后续功效评价奠定基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-2010 CHT高效液相色谱仪，LC/Labsoluion色谱工作站(日本岛津公司)；ME235S电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-5200DE数控超声波发生器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2试药没食子酸(批号110831-201605，质量分数90.8%)、绿原酸(批号110753-201415，质量分数96.2%)、阿魏酸(批号110773-201614，质量分数99.0%)、白藜芦醇(批号111535-201703，质量分数99.4%)、槲皮素(批号100081-201610，质量分数99.8%)、木犀草素(批号111520-201605，质量分数99.6%)和山柰酚(批号110861-201611，质量分数95.5%)对照品，均购自中国食品药品检定研究院；黑番茄浓缩浆(500 g·袋-1)，批号:20170606(S1)，20170607(S2)，20170608(S3)，20170609(S4)，20170610(S5)，20170611(S6)，20170612(S7)，20170613(S8)，20170614(S9)，20170615(S10)，由甘肃大漠紫光生物科技有限公司提供；乙腈、甲醇，色谱级，美国Honeywell公司；超纯水，自制。

2 指纹图谱的测定方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～50 min，95%→90%B；50～100 min，90%→85%B；100～120 min，85%→60%B；120～135 min，60%→30%B；135～140 min，30%→0%B。记录时间为140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取绿原酸对照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中,加体积分数为70%的甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg·mL-1的对照品溶液(参比物溶液)。

2.2.2供试品溶液精密称取本品浓缩浆10.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为90%的甲醇10 mL，将锥形瓶密塞后称定质量，超声处理(功率250 kW，频率40 kHz)30 min，放冷后再称定质量，加入体积分数为90%的甲醇补足减失的质量，振匀,滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验吸取2.2.2项下制备的供试品溶液(批号20170606)，连续进样6次，分别对样品中30个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果显示，30个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于2.0%和3.0%，结果表明，仪器精密度良好。

2.3.2稳定性实验吸取2.2.2项下方法制备供试品溶液(批号20160606)，分别于0，3，6，9，15和24 h进样，对样品谱图中30个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果显示，样品色谱图中30个共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于2.0%和3.0%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3重复性实验取6份供试样品(批号20170606)，按照2.2.2项下方法制备的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行分析，分别对谱图中30个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积进行分析。结果显示，30个共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于2.0 %和3.0 %，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.4指纹图谱的建立及相似度分析取10批黑番茄样品，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，进样量为20 μL，记录指纹图谱，见图1。由图1可知，图谱中峰11为绿原酸，即参比物，以此建立指纹图谱。10批样品的谱图中，30个共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值分别小于2.0%和3.0%，与指纹图谱研究技术的相关要求相符合，见图1至图2[9-10]。通过运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)对10批黑番茄浓缩浆的指纹图谱进行相似度分析，结果显示，通过对选定的30个共有色谱峰进行谱峰匹配，得出了样品指纹图谱的共有模式。谱图中各峰整体相似度为0.972～0.995；结果表明，这10批黑番茄浓缩浆中的化学成分具有良好的一致性。

图1黑番茄浓缩浆HPLC指纹图谱

1～30.特征指纹峰；1.没食子酸；11.绿原酸；17.阿魏酸；18.木犀草素；21.白藜芦醇；24.槲皮素；26.山柰素。

Fig.1 Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

1-30.characteristic fingerprint peaks；1.gallic acid； 11.chlorogenic acid；17.ferulic acid；18.luteolin；21.resveratrol；24.quercetin；26.kaempferol.

图210批黑番茄浓缩浆的HPLC指纹图谱

Fig.2 10 batches of Black tomato concentrated sauce HPLC fingerprint

3 含量测定方法与结果

3.1色谱条件色谱柱为Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-1.0 g·L-1磷酸水溶液(B)；梯度洗脱同2.1项下。记录时间为140 min。流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：325 nm；进样量：20 μL。

3.2混合对照品溶液的制备分别精密称取阿魏酸、木犀草素和山柰酚5.1，5.0和5.2 mg，置于同一25 mL量瓶中，加体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液为A溶液；另精密称取没食子酸、绿原酸、白藜芦醇和槲皮素9.6，26.0，5.0和 7.5 mg，置于同一25 mL量瓶中，精密加入A溶液1 mL，再加入体积分数为70%的甲醇定容至刻度，摇匀，得没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚对照品质量浓度分别为350.00，1 000.00，20.00，20.00，200.00，300.00和20.00 μg·mL-1的混合对照品溶液。

3.3供试品溶液的制备同2.2.2项下方法进行制备。

3.4线性关系分别精密量取3.2项下制备的混合对照品溶液0.01，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 mL，分别置于1 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，用0.22 μm微孔滤膜滤过，进样。以各对照品的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，计算，得线性方程，见表1，色谱图见图3。结果表明，各对照品在相应质量浓度范围内呈良好的线性关系。

表1对照品的线性方程及其质量浓度范围

Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substance

对照品名称线性范围/μg·mL-1线性方程 r没食子酸3．50～350．00y1=602．97x1+530．470．9996绿原酸10．00～1000．00y2=32213x2-609750．9996阿魏酸0．20～20．00y3=66388x3-5008．600．9993木犀草素0．20～20．00y4=14113x4-662．180．9995白藜芦醇2．00～200．00y5=78161x5-118070．9997槲皮素3．00～300．00y6=38184x6+2528．900．9997山柰酚2．00～20．00y7=25492x7-2451．500．9996

3.5精密度实验精密吸取2.2.2项下制备的供试品溶液(批号20170606)，重复进样5次，测得没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的RSD值分别为1.00%，0.75%，1.12%，0.89%，0.96%，0.93%和0.81%，结果表明，该方法精密度良好。

图3混合对照品HPLC图谱

1.没食子酸；2.绿原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜芦醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.3 Mixed reference substance HPLC fingerprint

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol；6.quercetin；7.kaempferol.

3.6稳定性实验精密吸取2.2.2项下制备的供试品溶液(批号20170606)，分别在第0，2，4，8，12和24 h进样。结果没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面积的RSD值分别为0.82%，0.92%，0.83%，0.87%，0.95%，0.77%和0.81%，结果表明，该溶液在24 h内稳定性良好。

3.7重复性实验精密称取6份供试品(批号20170606)，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照3.1项下色谱条件进样测定分析。结果表明，6份供试品中没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量分别为55.81，360.87，0.98，24.51，84.58，1.03和0.76 μg·g-1，RSD值分别为0.98%，1.05%，1.0%，1.04%，1.06%，0.92%和1.11%，结果表明，该方法重复性良好。

3.8加样回收率实验精密称取黑番茄浓缩浆(批号20170606)4.0 g，分别添加混合对照品溶液(精密称取没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚适量，制成每1 mL体积分数为70%的甲醇中分别含上述物质110.00，730.00，2.00，50.00，170.00，2.10和1.50 μg的混合对照品溶液)，再加入体积分数为70%的甲醇定容至刻度，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，按照3.1项下色谱条件进样测定，见表2。结果表明，该方法回收率良好。

表2加样回收率测定结果

Tab.2 Results of sample recovery test

化合物样品量/g原有量/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%没食子酸2．01240．11230．08800．198197．4399．370．772．02530．11300．08800．200299．012．03820．11380．11000．2239100．142．00110．11170．11000．220498．812．06400．11520．13200．2501102．172．00690．11200．13200．242298．66绿原酸2．01240．72620．58401．290496．6197．280．462．02530．73090．58401．303998．132．03820．73550．73001．449997．852．00110．72210．73001．421695．822．06400．74480．87601．609798．732．00690．72420．87601．569996．54阿魏酸2．01240．00200．00160．003596．7496．490．922．02530．00200．00160．003597．202．03820．00200．00200．004098．132．00110．00200．00200．003893．952．06400．00200．00240．004498．222．00690．00200．00240．004294．72白藜芦醇2．01240．04930．04000．087595．4796．230．642．02530．04960．04000．087795．202．03820．05000．05000．098396．712．00110．04910．05000．096995．772．06400．05060．06000．109798．472．00690．04920．06000．106795．77槲皮素2．01240．17020．13600．303197．6898．360．542．02530．17130．13600．306499．312．03820．17240．17000．341199．252．00110．16930．17000．333496．562．06400．17460．20400．3790100．182．00690．16970．20400．368097．19木犀草素2．01240．00210．00170．003795．6796．760．692．02530．00210．00170．003796．072．03820．00210．00210．004197．172．00110．00210．00210．004196．142．06400．00210．00250．004698．972．00690．00210．00250．004596．54山柰酚2．01240．00150．00120．002798．3899．690．632．02530．00150．00120．0027100．062．03820．00160．00150．0031101．402．00110．00150．00150．003097．942．06400．00160．00180．0034101．192．00690．00150．00180．003399．15

3.9含量测定精密量取10批供试品，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照3.1项下色谱条件进样分析。各批样品中没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量及RSD值分别见图4和表3。

图4黑番茄浓缩浆样品HPLC图

1.没食子酸；2.绿原酸；3.阿魏酸；4.木犀草素；5.白藜芦醇；6.槲皮素；7.山柰素。

Fig.4 HPLC fingerprint of Black tomato concentrated sauce samples

1.gallic acid；2.chlorogenic acid；3.ferulic acid；4.luteolin；5.resveratrol； 6.quercetin；7.kaempferol.

表3 10批黑番茄浓缩浆中7个成分含量测定结果

4 讨论

采用二极管陈列检测器全波长对黑番茄浓缩浆样品进行检验测定，依据三维色谱图，以及对各对应波长下峰的信息量的比较，结果表明，波长为280 nm时峰的信息量较多，故将其作为该HPLC指纹图谱的定性波长[11-14]；而在325 nm波长处时没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚7个化合物与相邻各峰之间的分离度均≥1.5[15]，故将其作为该HPLC法测定7个化合物的定量波长。由于该保健食品成分复杂，等度洗脱难以充分洗脱，故采用梯度洗脱的方法。通过对不同流动相系统乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水进行比较，结果显示，乙腈-1.0 g·L-1磷酸水溶液为理想流动相[16]。本制剂为果浆，选用溶剂为不同体积分数的甲醇(50%，60%，70%，80%，90%和100%)，结果显示使用体积分数为90%的甲醇时分离较佳；采用不同时间(10，15，20，30，40，50和60 min)超声或加热回流，结果显示超声30 min较理想。对不同柱温与流速进行比较，显示柱温超过或低于30 ℃时，谱图中大部分色谱峰分离度小或不能分开；当流速高于或低于0.8 mL·min-1时，大部分色谱峰的分离度差；色谱记录时间，在140 min之后，无色谱峰出现。因此，选择便于控制的柱温30 ℃，流速0.8 mL·min-1和记录时间140 min。

综上所述，通过对10批次的黑番茄浓缩浆样品进行相似度计算分析，结果显示相似度数值为0.972～0.995。同时，样品中7种成分的定量结果显示，各批次样品中上述7种成分的含量均一且稳定。表明笔者建立的黑番茄浓缩浆的HPLC指纹图谱方法与含量测定方法，具有良好的分析及评价能力，具有简便、稳定可靠、准确等明显优势。因此，该方法可用于黑番茄浓缩浆化学成分的含量检测，其指纹图谱适用于该保健食品的质量控制等评价方法。

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