乐安眠茶水溶性成分的HPLC指纹图谱及2种成分的溶出度研究

2018-05-18雷美娜肖会敏王四旺

西北药学杂志 2018年3期

雷美娜，肖会敏，何悦，王四旺

(空军军医大学药物研究所，西安 710032)

乐安眠茶又称清心安神桂仁茶，是由炒酸枣仁、茯苓、莲子、龙眼肉和百合5味药食同源的中药制成，主要作用是清心安神。炒酸枣仁为方中君药，有养心补肝、宁心安神和敛汗生津的功效，含有的酸枣仁总皂苷、总黄酮等成分，具有催眠、镇静作用[1]；茯苓可利水渗湿、健脾宁心[1]；莲子有补脾止泻、止带、养心安神、益肾涩精的功效[1]；龙眼肉具有补益心脾、养血安神的功效[1]；百合可养阴润肺、清心安神[1]。酸枣仁总黄酮可明显抑制小鼠的自发活动，拮抗咖啡因诱发的小鼠精神运动性兴奋，故认为总黄酮系酸枣仁中中枢抑制作用的主要有效成分，其中斯皮诺素为酸枣仁总黄酮中的主要有效成分[2-3]。腺苷是生物小分子化合物，药用价值显著，具有抗病毒、抗凝血、扩张冠状动脉、镇静中枢神经和抗心率不齐等作用，为龙眼肉中镇静安神的主要成分[4-6]。经文献检索未发现该茶剂的研究报道。因此，本文运用HPLC法对该茶剂水溶性成分进行分析，建立HPLC指纹图谱，测定斯皮诺素及腺苷的含量及不同泡茶时间二者的溶出度。

1 仪器与试药

1.1仪器 Prominence UFLC，岛津高效液相色谱仪(配LC-20AD双泵，CTO-20A柱温箱，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20ACHT自动进样器)，LC/labsoluion色谱工作站(日本岛津公司)；KQ-300DE数控超声波发生器(昆山超声仪器有限公司)；BSA124S电子分析天平(德国赛多利斯公司)。

1.2试药斯皮诺素对照品(批号111869-201203，质量分数以95.4%计)，腺苷对照品(批号2110879-200202，质量分数以99.7%计)，均购自中国食品药品检定研究院；炒酸枣仁、茯苓、莲子、百合和龙眼肉药材，均购自西安藻露堂集团藻露堂药业有限公司；乐安眠茶(批号：S1：20161106，S2：20161107，S3：20161108，S4：20161109，S5：20161110，S6：20161111，S7：20161112，S8：20161113，S9：20161114，S10：20161115)，由陕西含光生物科技有限公司研制并提供；乙腈、甲醇，色谱级，美国Fisher公司；超纯水，纯水仪购自美国Millipore公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Kromasil C18(250 nm×4.6 mm，5 μm)。流动相：甲醇(A)-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(B)(5∶95),高压梯度洗脱程序：0～10 min，B 95%→90%；10～60 min，B 90%→40%；60～65 min，B 40%；65～65.1 min，B 40%→0%；65.1～70 min，B 0%；70～70.1 min，B 0%→95%；70.1～75 min，B 95%，记录时间为60 min。流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：260 nm；进样量：50 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液分别精密称取斯皮诺素对照品和腺苷对照品11.01和5.12 mg，置于同一25 mL量瓶中，加体积分数为70%的甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2供试品溶液取3袋乐安眠茶剂，混合并研细，精密称取4.5 g，置于100 mL的温水中超声处理30 min，滤过，取滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3阴性对照溶液

2.2.3.1酸枣仁阴性对照溶液按照处方比例精密称取缺酸枣仁的阴性对照茶剂4.5 g，置于100 mL温水中，超声处理30 min，滤过，取滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3.2龙眼肉阴性对照品溶液按照处方比例精密称取缺龙眼肉的阴性对照茶剂4.5 g，置于100 mL温水中超声处理30 min，滤过，取滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3指纹图谱的测定

2.3.1精密度实验取乐安眠茶剂3袋(批号20161106)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，连续进样6次，每次50 μL，分别对各共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。经计算得出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别小于2.45%和2.62%，结果表明，该仪器精密度良好。

2.3.2稳定性实验取乐安眠茶剂3袋(批号20161106)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，分别于0，2，4，8和12 h进样，分析共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别小于1.0%和2.00%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.3重复性实验取乐安眠茶剂6份(批号20161106)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别小于0.85%和2.80%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.4指纹图谱的建立及相似度评价取10批供试样品，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。共选定31个共有峰，其中峰11确定为腺苷，峰25为斯皮诺素，峰26为芦丁[7-8]，由于峰26分离度较差，峰面积小，故选用腺苷和斯皮诺素为参比物建立乐安眠茶水溶性成分的指纹图谱[9-11]。10批供试品共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2.00%，见图2。符合相关要求。运用文献要求对各批样品的指纹图谱进行相似度分析[12]，对选定的31个共有色谱峰进行谱峰匹配，通过计算得出样品指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准，进行整体相似度评价，结果相似度为0.993～0.997，结果表明，各样品的化学成分一致性较好。

图1乐安眠茶HPLC指纹图谱

1～31. 特征指纹峰；11.腺苷；25.斯皮诺素(作为参照物的色谱峰)。

Fig.1 HPLC fingerprint of Leanmian Tea

1-31.characteristic fingerprint peak;11.adenosine；25.spinosin(reference peak).

图210批乐安眠茶的HPLC指纹图谱

Fig.2 10 batches of Leanmian Tea HPLC fingerprint

2.4含量测定

2.4.1线性范围精密吸取对照品溶液0.015，0.030，0.040，0.050，0.060，0.100和0.150 mL，分别置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，分别吸取各质量浓度溶液50 μL进样，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(y)、对照品溶液质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)，绘制标准曲线，计算得斯皮诺素线性回归方程y=67 703x-67 517，r=0.999 5(n=2)；腺苷线性回归方程y=181 733x+5 185.5，r=0.999 4 (n=2)。结果表明，斯皮诺素和腺苷质量浓度分别在3.15～31.50和1.53～15.3 μg·mL-1范围内呈良好线性关系。

2.4.2专属性实验取斯皮诺素对照品溶液、供试品溶液、酸枣仁阴性对照溶液、腺苷对照品溶液和龙眼肉阴性对照溶液各50 μL，进样，按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，见图3。由图3可知，分离良好，且阴性对照无干扰，结果表明，该方法专属性良好。

图3HPLC图

A.混合对照品；B.乐安眠茶；C.酸枣仁阴性对照；D.龙眼肉阴性对照；1.腺苷；2.斯皮诺素。

Fig.3 HPLC chromatograms

A．mixed reference substances；B.Leanmian Tea；C.Ziziphispinosaesemen negative control；D.DimocarpuslonganLour.negative control；1.adenosine；2.spinosin.

2.4.3精密度实验精密量取2.2.1项下制备的混合对照品溶液0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得，用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别取50 μL进样，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，连续进样5次。测得斯皮诺素和腺苷峰面积的RSD值分别为0.10%和0.21%，结果表明，该仪器精密度良好。

2.4.4稳定性实验精密量取2.2.1项下制备的混合对照品溶液 0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别于0，1，2，4，6，8和12 h进样，每次进样50 μL，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，测得斯皮诺素和腺苷峰面积的RSD值分别为0.19%和0.15%。结果表明，该样品在12 h内稳定。

2.4.5重复性实验精密称取供试样品6份(批号20161107)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，测得斯皮诺素和腺苷的平均含量分别为0.062 4和0.058 1 mg·g-1，RSD值分别为1.76%和1.09%，结果表明，该方法重复性良好。

2.4.6加样回收实验取供试样品6份(批号20161107)，研细，取3 g，分别精密量取并添加0.40，0.40，0.47，0.47，0.57和0.57 mL混合对照品溶液(精密称取斯皮诺素和腺苷对照品10.50和9.50 mg，置于同一25 mL量瓶中，用体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，见表1。结果表明,该方法回收率良好。

表1加样回收率测定结果

Tab.1 Results of recovery test

化合物名称取样量/g原有量/mg添加量/mg测出量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%斯皮诺素2．90970．180．170．345397．235398．230．923．20810．200．170．365497．29413．12010．190．200．387898．90003．24860．200．200．396698．30003．07150．190．240．425498．08333．27890．200．240．438999．5417腺苷2．90970．170．140．304996．3696．240．893．20810．190．140．325796．933．12010．180．180．355197．283．24860．190．180．361495．223．07150．180．220．392196．413．27890．190．220．399595．23

2.4.7样品的含量测定精密称取10批样品，分别按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定。各批样品中斯皮诺素和腺苷的平均含量分别为0.083 4和0.059 1 mg·g-1，RSD值分别为1.22%和1.13%。

2.5不同泡茶时间斯皮诺素的溶出度测定测定方法依据2.1项下色谱条件与相关文献方法[13]：精密称取1袋供试品，加入温水100 mL浸泡，分别于浸泡5，10，15，30，40，50，60，90和120 min时取样，并按照2.1项下色谱条件测定峰面积，根据线性方程计算水提液中斯皮诺素的含量，结果见表2。

表2 斯皮诺素溶出情况测定结果

3 讨论

3.1指纹图谱的测定

3.1.1样品制备方法的选定为研究乐安眠茶剂的水溶性成分，通过筛选得出：精密称取4.5 g该茶剂，用100 mL温水超声30 min，过滤，取滤液，作为供试品，得到的HPLC图各峰分离度良好，且峰面积在线性范围内，故选定HPLC法作为制样方法，以此对乐安眠茶水溶性成分的指纹图谱及斯皮诺素、腺苷的含量测定进行研究。

3.1.2流动相的选定曾选用乙腈-水(15∶85)、甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(5∶95)作为流动相，但分离效果不理想，最终采用甲醇-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95)作为流动相进行梯度洗脱，各峰分离度良好，峰形较好[14-15]。

3.1.3波长的选定参考文献[16-18]，参比物斯皮诺素的最大吸收波长为335 nm，腺苷的最大吸收波长为260 nm，但在335 nm波长下出峰较少，且各峰分离度较差，故选用190，245，260，270和300 nm下考察各自波长下的色谱图，经比较发现在260 nm波长下各峰分离度良好，且斯皮诺素和腺苷的峰形较好，故选用260 nm作为检测波长。

3.1.4参比物的选择本文前期通过对31个共有峰的考察确定了峰11，25和26分别为腺苷、斯皮诺素和芦丁，但由于芦丁含量少，且分离度差，故选用腺苷和斯皮诺素作为参比物。

3.1.5其他条件的选择将不同柱温(25，30，35和40 ℃)下的色谱图进行比较，发现35 ℃时峰的分离度较好，故确定柱温为35 ℃；进样量为50 μL时各峰特征性强，峰形较好，故确定进样量为50 μL[19-20]。

3.2样品含量测定通过考察可得指纹图谱测定中的溶液制备方法及测定条件对斯皮诺素及腺苷的含量测定同样适用。因腺苷和斯皮诺素的含量稳定且分离度较好，故选定腺苷和斯皮诺素2种成分进行含量测定分析。

3.3样品溶出度测定

3.3.1样品制备方法的选定由于本品为保健茶剂，服用方法为温水浸泡后饮用，故对该茶剂不同泡水时间内斯皮诺素和腺苷的含量比较研究时选用开水浸泡的方法。经考察得出，1袋乐安眠茶剂用100 mL开水浸泡所得色谱图各峰分离度较好，故选定该方法为样品的制备方法。

3.3.2样品测定条件的选择通过考察可得指纹图谱测定中的方法对本项实验同样适用。综上所述，通过对10批样品水溶性成分进行相似度计算，数值为0.993～0.997。同时斯皮诺素和腺苷的含量均一稳定，表明建立的乐安眠茶指纹图谱方法与含量测定方法有良好的分析评价能力，具有简便、科学、可靠等明显优势，可用于该茶剂的质量控制及调节泡茶时间。

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