has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因多态性与新疆汉族和维吾尔族乳腺癌的相关性研究*

陈 晶，赵 璐，宋 牧，木拉提·库尔班，邹庆涛，孙国辉

(新疆医科大学第二附属医院肿瘤科,乌鲁木齐 830000)

乳腺癌是一种高发的多基因性疾病，遗传基因易感性起着重要作用，发病存在一定的种族、地域及社会阶层的差异性[1]。新疆维吾尔族居住地域特色鲜明，本课题组前期工作发现，其与汉族乳腺癌相比表现为发病年龄较早，病期晚，淋巴结转移率高，预后较差等特点，因而认为维吾尔族乳腺癌发病可能有其特定的种族遗传易感性[2]。微小RNA(miRNA)在乳腺癌的发生、发展中扮演重要角色，成为目前研究的热点[3]。本研究从相关pre-miRNA位点has-miR-125a-5p、 hsa-miR-196a2 单核苷酸基因多态性入手，通过分离外周血淋巴细胞获取标本，采用RT-PCR技术检测维吾尔族和汉族乳腺癌患者外周血的基因多态性，并以健康人群作为对照进行分析，为开展个体化预防和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 经本院医学伦理委员会同意(批准文号：20140131L001)，选取2014年1月至2017年1月新疆医科大学第二附属医院及附属肿瘤医院收治的女性乳腺癌患者200例为病例组(维吾尔族及汉族各100例)。纳入标准：(1)初治原发性乳腺癌病例，无手术和放化疗病史；(2)维吾尔族及汉族女性，卡氏评分大于或等于80分，可完成手术切除；(3)无严重的其他脏器功能障碍和并发症，在新疆地区居住满10年以上。病例组年龄25～72岁；BMI 19～28 kg/m2；在新疆地区居住时间11～53年。另取女性志愿者200例为对照组(维吾尔族及汉族各100例)，纳入标准：(1)按年龄进行1∶1匹配选择对照，年龄配比在±5岁范围内；(2)同期参加健康体检且结果健康的维吾尔族及汉族女性；(3)在新疆地区居住满10年以上，并排除恶性肿瘤、生殖系统疾病、内分泌疾病和肝肾疾病。对照组年龄24～70岁；BMI 20～28 kg/m2；在新疆地区居住时间14～55年。所有研究对象对本次试验知情并签署同意书，病例组与对照组在年龄、BMI和新疆地区居住时间方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

1.2方法

1.2.1实验仪器与试剂 (1)7700全自动荧光PCR检测仪，购自美国Applied Biosystems公司；(2)低温高速离心机，购自德国EPPENDOR公司；(3)超纯水，购自美国PROMEGA公司；(4)移液枪、吸头和离心管，购自上海和森生物科技有限公司；(5)基因提取试剂盒、引物及探针，购自美国Applied Biosystems公司。

表1 两组一般资料比较

1.2.2研究方法

1.2.2.1患者临床资料收集 参阅以往同类研究，制订人口学特征调查问卷[4]。由经过专门训练的调查者通过面访的方式对病例组进行调查，内容包括：年龄、文化程度、BMI、婚姻状况、生育史、哺乳状况、哺乳时间和癌症家族史。同时收集患者肿瘤病理学特征，包括：肿瘤大小、淋巴结转移个数、美国癌症联合委员会(American joint committee on cancer，AJCC)分期、受体表达情况[激素受体(hormone receptor，HR)、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progestrone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)]及分子分型。

1.2.2.2RT-PCR操作步骤 (1)样品RNA的抽提：取所有研究对象冻存已裂解的细胞，室温放置5 min使其完全溶解，两相分离，RNA沉淀，RNA清洗，RNA干燥，溶解RNA沉淀。(2)RNA质量检测。(3)样品cDNA合成。(4)梯度稀释的标准品及待测样品的基因实时定量PCR。(5)制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板；选择表达has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的cDNA模板进行PCR反应，PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释。(6)待测样品的待测基因实时定量PCR：所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系；将配置好的PCR反应溶液置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。

1.2.3观察指标 (1)病例组中汉族与维吾尔族患者人口学特征及肿瘤病理学特征；(2)病例组和对照组不同民族患者has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的表达水平。

2 结 果

2.1汉族与维吾尔族乳腺癌患者人口学特征比较 年龄阶层方面，汉族和维吾尔族患者35～65岁的比例最高；BMI方面，汉族患者小于25 kg/m2的比例较大，维吾尔族患者大于或等于25 kg/m2的比例较大；文化程度方面，汉族患者高中的比例最高，维吾尔族患者高中以下的比例最高；婚姻状况方面，汉族和维吾尔族患者已婚的比例较大；生育状况方面，汉族患者1胎的比例最高，维吾尔族患者1胎以上的比例最高；汉族和维吾尔族患者有哺乳史的比例较大；哺乳时间方面，汉族和维吾尔族患者大于或等于10个月的比例较大；汉族和维吾尔族患者无癌症家族史的比例较大，见表2。

表2 汉族与维吾尔族乳腺癌患者人口学特征比较(%)

2.2汉族与维吾尔族乳腺癌患者肿瘤病理学特征比较 肿瘤大小方面，汉族患者小于2 cm的比例最高，维吾尔族患者2～5 cm的比例最高；淋巴结转移个数方面，汉族和维吾尔族患者0个的比例最高；AJCC分期方面，汉族和维吾尔族患者Tis～Ⅱ期的比例较高；分子分型方面，汉族和维吾尔族Luminal B型的比例最高；汉族患者HR(+)的比例高于维吾尔族患者(P<0.05)，两组ER、PR和Her-2表达情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 汉族与维吾尔族乳腺癌患者肿瘤病理学特征比较(%)

2.34组has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因表达水平比较 经RT-PCR检测，has-mir-125a-5p在4组中表达量由高到低依次为汉族对照组、维吾尔族对照组、汉族病例组和维吾尔族病例组，has-mir-196a2在4组中表达量由高到低依次为维吾尔族病例组、汉族病例组、维吾尔族对照组和健康汉族对照组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 4组has-mir-125a-5p和has-mir-196a2 基因表达水平比较

a：P<0.05，与维吾尔族病例组比较；b：P<0.05，与维吾尔族对照组比较；c：P<0.05，与汉族病例组比较

3 讨 论

数据表明，全世界每年新增乳腺癌患者约为130万，其中约45万死于该病[5]。近年来，我国乳腺癌的发病率和病死率也呈逐年递增的趋势，并且具有年轻化、家族聚集等特征[6-7]。在新疆地区，乳腺癌是继宫颈癌后第2位危害女性健康和家庭幸福的恶性肿瘤，因此，做好乳腺癌的防治工作具有深远的社会意义。新疆是个多民族聚集地，以汉族和维吾尔族为主，分别占总人口的45.7%和39.8%，维吾尔族女性在乳腺癌的发病上与汉族存在明显差异，表现为原发病灶体积大、淋巴结转移多及预后差等特征。除饮食习惯、婚育情况等人口学特征外，基因也是形成维吾尔族与汉族女性乳腺癌发病差异的重要因素[8]。miR-125是在小鼠脑组织中克隆得到的与线虫miRNA-Lin-4高度同源的miRNA，具有前体和成熟体两种形式。成熟体可继而分为has-mir-125a-5p和has-mir-125a-3p。在已有的研究报道中，has-mir-125a的研究主要集中在has-mir-125a-5p[9]。有学者以乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤为材料，分析得出肿瘤中miRNA编码区表现出很高的突变频率并发现乳腺癌中has-mir-125a-5p成熟序列中单核苷酸多态性可使miRNA表达量下调[10]。在人类基因组中，miRNA前体区域has-mir-125a-5p位于染色体19q13.41，这一区域常常在恶性肿瘤中被削减，因此可推断其作为抑癌基因参与了乳腺癌的发生、发展过程[11]。研究发现，has-mir-196a的单核苷酸多态性与肺癌患者的预后相关，同时也提高了我国女性乳腺癌的发病风险，其机制可能与下调Hox基因家族成员和膜链蛋白Al的表达有关[12]。尽管以上研究提示has-mir-125a-5p和has-mir-196a的单核苷酸多态性影响了乳腺癌的发病风险，但民族间的突变比较研究尚待进一步开展。

从本次研究的结果来看，与汉族患者相比，维吾尔族患者年龄偏小，BMI较高，生育数量较多，哺乳时间较长，可能是由环境因素及相关民族政策导致，维吾尔族女性以高热量饮食为主，多数早婚、多育，且基本上为母乳喂养；维吾尔族患者肿瘤较大、淋巴结转移个数较多、AJCC分期较高，Basal-like型乳腺癌比例较高，HR阴性的比例较高，与李双武等[13]研究的结果一致。说明与汉族女性相比，新疆地区维吾尔族乳腺癌患者预后较为不良，可能与上述人口学特征方面的差异有关。在李鹏飞等[14]的研究中，乳腺癌患者血浆has-mir-125a-5p水平低于健康人群，has-mir-196a2水平高于健康人群，本次研究中has-mir-125a-5p和has-mir-196a2在4组中表达量与该结果相吻合，同时与has-mir-125a-5p的抑癌作用及has-mir-196a2的致癌作用一致。因此，本研究推测上述两基因某些位点的突变造成乳腺癌遗传易感性的变化是导致维吾尔族与汉族乳腺癌预后差异的重要因素。值得一提的是，维吾尔族对照组与

汉族病例组间两基因表达量的差异，在接下来的研究中本课题组应以has-mir-125a-5p与has-mir-196a2基因的单核苷酸多态性为切入点，进行不同基因型与预后的相关性研究。

综上所述，与新疆地区汉族女性相比，维吾尔族乳腺癌患者总体预后较差，其机制可能与has-mir-125a-5p和has-mir-196a2基因的表达有关，对相关miRNAs基因的检测可为筛查及预防提供理论依据。

参考文献

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