正交实验法优选丁香总黄酮的超声波辅助提取工艺

李利华

(陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000)

丁香(Eugeniacaryophyllata)，为桃金娘科蒲桃属热带植物丁香的干燥花蕾，又称公丁香。丁香原产于印度尼西亚、马来西亚、坦桑尼亚等地，自20世纪50年代引入我国南方地区栽培，其花蕾为重要的食用香辛调料和中药材[1]。祖国医学认为[2]，丁香性味辛、温，归脾、胃、肺、肾经，具有温中降逆、散寒止痛、补肾助阳的功效。现代研究表明[3]：丁香中含有挥发油、黄酮、多酚等多种活性成分，具有抑菌、镇痛、麻醉、抗氧化和抗癌等生物活性。目前，有关丁香中挥发油的研究已有相关的报道[4,5]，而关于丁香中黄酮类物质提取的研究报道较少。

黄酮类化合物(Flavonoids)是一类广泛存在于植物的根、茎、果、叶、皮中的次生代谢产物，多数与糖类结合成甙而存在的天然有机化合物[6]。近年来已有研究证实[7，8]，黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，能够有效阻断人体脂质自氧化，清除体内过量自由基，延缓机体衰老等，是目前研究的热点。本研究采用超声波辅助法提取丁香中的黄酮类化合物，先通过考察丁香总黄酮提取的4个主要影响因素：提取剂(乙醇)浓度、提取温度、料液比和提取时间对丁香总黄酮提取率的影响，再采用正交实验法优化丁香总黄酮的超声波辅助提取工艺参数条件，皆为丁香总黄酮的开发利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丁香：购自汉中市健康大药房，经陕西理工大学生物系李新生教授鉴定为桃金娘科蒲桃属热带植物丁香的干燥花蕾。

芦丁标准品：优级纯，购自中国药品生物制品检定所；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等：以上试剂均为国产分析纯；实验用水：二次蒸馏水。

KQ-700VDE三频式超声波处理器 昆山超声仪器公司；UV型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；TD-214型电子分析天平 北京梅特勒-托利多仪器有限公司；中草药粉碎机 河北宏博中药机械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丁香总黄酮提取工艺流程

丁香清洗→低温烘干至恒质量→粉碎→石油醚脱脂、脱色→挥发尽溶剂→乙醇浸提总黄酮→真空抽滤→测定提取液吸光度→真空干燥得丁香粗总黄酮。

1.2.2 丁香总黄酮提取率的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[9]，以芦丁为标准对照品，于510 nm处测定吸光度值，以吸光度值(A)为纵坐标、总黄酮含量(C)为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程：A=1.077C+0.135，R=0.9986。

精密移取丁香总黄酮浸提液1.0 mL于10 mL比色管中，分别加入10%的NaNO20.3 mL，10%的Al(NO3)30.3 mL， 4%的NaOH 4.0 mL，以60%乙醇补足至刻度线，室温下反应15 min，利用紫外-可见分光光度计在波长510 nm下测定吸光度A，代入标准曲线方程计算总黄酮含量，并计算总黄酮浸提率，每个样品做3份重复。

1.2.3 单因素实验设计

以丁香总黄酮提取率为衡量指标，恒定超声波功率280 W，分别考察4个主要因素：乙醇浓度(40%，50%，60%，70%，80%，90%)、料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、提取温度(40，50，60，70，80，90 ℃)和提取时间(30，45，60，75，90，105 min)对丁香中黄酮类物质提取率的影响，每个处理做3份平行，选取各因素的适宜水平范围。

1.2.4 正交实验设计

由单因素实验结果，利用L9(34)正交实验表[10]，优化丁香总黄酮的超声波辅助提取最佳工艺参数条件，因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平

1.2.5 实验数据处理

使用Origin 8.0和SPSS 17.0处理数据并做图。

2 结果与分析

2.1 单因素结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响

图1 乙醇浓度对提取率的影响

由图1可知，乙醇浓度在40%～70%范围内，丁香总黄酮提取率随乙醇浓度的增大呈上升趋势，且在乙醇浓度70%时提取率最高，为8.25%；而当乙醇浓度高于70%后，总黄酮提取率有所下降；这可能是浓度为70%的乙醇与丁香总黄酮的亲和能力最强，促使丁香总黄酮最大限度地溶出。因此，乙醇浓度选择70%左右为最佳浓度条件。

2.1.2 提取温度对提取率的影响

图2 提取温度对提取率的影响

由图2可知，在40～70 ℃范围内，丁香总黄酮的提取率随着提取温度的升高明显增加，提取温度为70 ℃时总黄酮提取率达最大值，为7.98%，之后提取温度继续升高，总黄酮提取率开始下降，90 ℃时总黄酮提取率仅为6.79%。这说明适度升温加快了分子的扩散速度，有利于丁香总黄酮的浸出；而提取温度过高一方面会引起乙醇溶剂的挥发，另一方面高温会使丁香中杂质的溶出量增加，导致丁香总黄酮提取率下降。因此，选择提取温度70 ℃左右。

2.1.3 料液比对提取率的影响

图3 料液比对提取率的影响

由图3可知，在料液比由1∶10增加到1∶30过程中，丁香总黄酮提取率上升较快，说明适度增大提取剂的用量有利于原料和提取剂的充分接触，增加浓度的梯度差，从而提高其提取率；在料液比1∶30～1∶40过程中，丁香总黄酮提取率增大幅度较少，且在料液比1∶40时提取率达最大值7.55%，之后提取率逐渐下降；这可能是当总黄酮溶出已基本饱和后，再增大提取剂用量会使其他杂质的溶出增多，影响总黄酮的提取率。因此，选择料液比为1∶40左右。

2.1.4 提取时间对提取率的影响

图4 提取时间对提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，丁香总黄酮的提取率呈现先上升后下降的趋势，在提取时间为75 min时丁香总黄酮提取率最高，为7.43%，提取时间超过75 min，丁香总黄酮提取率逐渐下降。这说明适当延长提取时间，有利于丁香总黄酮活性成分在溶剂中的充分扩散和溶出，而提取时间过长，会使溶液中已溶出的总黄酮物质分解，从而导致丁香总黄酮提取率的下降。因此，选用提取时间75 min左右。

2.2 正交实验结果及分析

表2 正交实验结果

由表2可知,A(乙醇浓度)对丁香总黄酮的提取率影响最大，其次是B(提取温度)，D(提取时间)对丁香总黄酮提取率影响最小，优化得到的最佳提取工艺条件为A2B3C2D3，即：乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，料液比1∶40，提取时间90 min。

表3 方差分析表

由表3可知，4个因素中A(乙醇浓度)对丁香总黄酮的提取率具有显著性影响，其他3个因素均无显著性影响。

2.3 验证实验

因利用L9(34)正交实验优化得到的丁香总黄酮最佳提取工艺条件与表2中的9组实验不重复，故通过验证实验考察该工艺条件的稳定性，在最佳工艺条件下(乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，料液比1∶40，提取时间90 min)提取丁香总黄酮，并测定总黄酮提取率，制备3份平行试样，得到丁香总黄酮平均提取率为(8.51±0.03)%，高于正交实验设计中的9组总黄酮提取率数值，表明该工艺条件比较稳定，可以作为丁香总黄酮的超声波辅助提取的最佳工艺条件。

3 结论

本研究通过单因素实验和正交实验设计对丁香总黄酮的超声波辅助提取工艺进行优化。实验结果表明：乙醇浓度对丁香总黄酮的提取达到显著性水平，优化得到的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，提取温度80 ℃，料液比1∶40，提取时间90 min；验证实验结果显示：在优化得到的最佳工艺条件下，丁香总黄酮提取率为(8.51±0.03)%，高于正交实验设计表中的数值，表明该工艺条件稳定，可以作为丁香总黄酮的超声波辅助提取工艺条件，为丁香总黄酮的工业化生产提供一定的数据参考，为丁香资源的进一步开发利用提供了理论依据。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:4.

[2]张卫明,肖正春.中国辛香料植物资源开发利用[M].南京:东南大学出版社,2007:640.

[3]江慎华,王书源,马海乐,等.丁香活性物质提取工艺优化与抗氧化活性研究[J].农业机械学报,2010,41(1):132-138.

[4]蔡君龙,卢金清,黎强,等.不同产地丁香挥发性成分分析[J].植物科学学报,2015,33(2):251-258.

[5]张小飞,万娜,王学成,等.丁香挥发油理化性质、 提取工艺参数与其芳香水稳定性的相关性研究[J].中草药,2016,47(22):3975-3980.

[6]延玺,刘会青,邹永青,等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].有机化学,2008,28(9):1534-1544.

[7]曹志超,顾翔,苏佩清.黄酮类化合物抗氧化及其作用机制的研究进展[J].实用临床医药杂志,2009,13(7):110-112.

[8]Cushine T P,Lamb A J.Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids[J].Int J Antimicrob Agents, 2011,38(9):99-107.

[9]李利华.大蒜总黄酮的超声波辅助浸提及其抗氧化活性[J].食品与发酵工业,2013,39(12):213-216.

[10]何为,薛卫东.优化实验设计:方法及数据分析[M].北京:化学工业出版社，2014:6-12.