四种葱属植物醇提物抗氧化活性比较

刘阳，王硕，李莎莉，吴琦，许悦，王丽虹

(武昌理工学院 生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，武汉 430223)

葱属植物(Allium)为百合科(Liliaccae)葱族(Allieae)，约400 多个品种，我国境内约有100 多种，其中作药用的约20 余种。《本草纲目》也有关于“正月葱，二月韭”的记载，指农历正月的香葱和二月后生长的韭菜最有益于人体健康，具有医治胸闷、伤寒、风湿、解渴等功效[1]。葱属植物含有维生素C、蛋白质、多糖、氨基酸等多种营养成分以及丰富的黄酮类化合物、含硫化合物、多糖等生物活性物质，具有抗血小板凝集、抑菌、抗氧化等多种生理功能[2，3]。李璐等研究表明：不同种葱属植物抗氧化活性差异较大，而同种植物不同溶剂提取物中主要活性物质的含量差别也较大，其中醇提物中含有较高的黄酮类化合物，而具有较强的抗氧化活性[4]。研究结果显示：细香葱醇提物中黄酮类化合物和含硫化合物含量显著高于其他溶剂提取物，而成为抗胃癌活性部位。

现代医学研究和临床试验证明：人体内的自由基动态平衡被打破时，就会出现各种氧化损伤，形成大量畸变的蛋白分子，诱发肿瘤等多种疾病[5]。随着对自由基研究的逐步深入，研究者们已认识到体内多余自由基的清除有利于某些疾病的预防和治疗，因此开发和利用无毒、高效的天然抗氧化剂对人体健康意义重大，是食品科学、生命科学和医学领域的研究热点[6]。大蒜(AlliumsativumL.)、韭菜(AlliumtuberosumRottl.)、洋葱(AlliumcepaL.)大葱(AlliumfistulosumL.)是我国常见、历史悠久的药食两用鳞茎植物，本研究采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(·OH)清除率和总还原能力多种方法对4种葱属植物醇提物的体外抗氧化能力进行评价和比较，以期为筛选活性较强的天然抗氧剂和葱属植物药食资源的深度开发提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

新鲜洋葱、大蒜、韭菜、大葱：购于武商量贩江夏店(产地：湖北)；DPPH(批号：M07334)：成都西亚化工股份有限公司；邻苯三酚等：均为国产分析纯；实验用水：为纯化水。

1.2 仪器

UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；雷磁 pHs-3C pH计 上海仪电科学仪器有限公司；SB-3200DT超声仪 宁波新芝生物有限公司；UPT-II-10T优普超纯水器 成都超纯科技有限公司；CPA225D电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 葱属植物醇提液的制备

分别取洗净晾干的新鲜洋葱、大葱、韭菜及大蒜(去皮)20 g，加入160 mL 70%乙醇搅拌成粘稠状态，35 ℃超声40 min，抽滤，保留滤液，滤渣中加入80 mL 70%乙醇混合均匀同法处理，合并2次滤液。取适量滤液测定含量，以芦丁计，其醇提液中黄酮含量分别为大蒜0.184 mg/mL，洋葱0.179 mg/mL，大葱0.128 mg/mL，韭菜0.124 mg/mL。

2.2 DPPH·清除率的测定

DPPH·于517 nm波长处有强吸收，加入抗氧剂(样品)后，孤对电子被配对[7]，吸收强度减弱。因此，可通过测定吸光度来评价样品的DPPH·清除能力。

参考郭奎彩等[8]的方法，并加以改进。在预实验的基础上，将葱属植物醇提液用70%乙醇稀释5倍作为样品溶液。从中分别取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，加70%乙醇补充至2.00 mL后，均加入0.2 mmol/L DPPH·溶液(95%乙醇配制) 2.0 mL，摇匀后室温避光反应40 min，再于517 nm处测定吸光度，根据公式(1)计算清除率。

(1)

式中：A0为DPPH·溶液的吸光度，A1为样品与DPPH·反应后的吸光度，A2为样品溶剂的吸光度。

2.3 O2-·清除率的测定

根据文献[9]可知，通过测定邻苯三酚反应体系吸光度的大小可评价样品对O2-·的清除能力。

将葱属植物醇提液用70%乙醇稀释10倍作为样品溶液，从中分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL，加入6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)摇匀，于37 ℃水浴中孵育10 min，再加入1.0 mL 7 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液(37 ℃预热)，混匀后在相同温度下反应4 min，然后加入0.5 mL浓盐酸终止反应，在325 nm处测定样品吸光度A1；以等体积的上述缓冲溶液代替样品，同法操作，测得空白吸光度A0[10]，根据公式(2)计算样品对O2-·的清除率。

(2)

式中：A0为空白的吸光度，A1为样品的吸光度。

2.4 ·OH 清除率的测定

·OH 清除率是反映药物抗氧化活性的重要指标，可采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定[11]，其原理是：H2O2在邻二氮菲-Fe2+催化下分解成·OH，自身被·OH氧化成邻二氮菲-Fe3+使510 nm处的最大吸收消失。向体系中加入的抗氧剂(样品)能与·OH反应而减少邻二氮菲-Fe2+的损失[12]，通过测定体系510 nm处的吸光度可评价样品的·OH 清除能力。

将葱属植物醇提液用70%乙醇稀释5倍作为样品溶液，分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL后，各加入1.5 mL 5 mmol/L邻二氮菲、4.0 mL 0.5 mol/L PBS(pH 7.4)、1.0 mL 7 mmol/L FeSO4和0.1% H2O2溶液1.0 mL，均补加纯水至10.0 mL，于37 ℃水浴反应90 min后在510 nm处测定吸光度，按照公式(3)计算·OH的清除率。

(3)

式中：A2为样品溶液的吸光度，A0为以纯水代替样品的吸光度，A1为样品和H2O2均以纯水代替的吸光度。

2.5 总还原能力的测定

由于铁氰化钾中的Fe3+会被葱属植物中的某些成分还原，生成的普鲁士蓝在700 nm处有最大吸收, 其吸光度值与还原能力呈正相关。所以可以用此方法比较吸光度值的大小，间接测定4种葱属植物的抗氧化活性大小。

取葱属植物醇提液用70%乙醇稀释5倍为样品溶液，分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾和2.5 mL 0.2 mol/L PBS(pH 6.6)，混匀后于50 ℃水浴反应30 min，急速冷却并加入2.5 mL 10%三氯乙酸水溶液，摇匀，于4000 r/min离心10 min后取上清液2.5 mL，加入蒸馏水和0.1% FeCl3溶液各2.5 mL，摇匀并静置10 min后测700 nm处的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 4种葱属植物对DPPH·的清除能力

根据2.2进行操作，4种葱属植物对DPPH·的清除率结果见图1。

图1 4种葱属植物醇提物的DPPH·清除率Fig.1 The DPPH radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由图1可知，4种葱属植物对DPPH·均具有一定的清除能力，但随浓度升高其清除率增加不明显；在实验的浓度范围内，大蒜、洋葱、大葱、韭菜对DPPH·的清除率分别达到95%，85%，60%和40%以上，因此DPPH·清除率大小顺序为：大蒜>洋葱>大葱>韭菜；相同体积下，大蒜对DPPH·的清除率稍高于洋葱，而达到韭菜的1.8倍左右，显示了较强的DPPH·清除能力。总体来说，4种葱属植物对DPPH·都有一定的清除作用，但效果区别明显，其中大蒜的清除效果较强，韭菜的较弱。

3.2 4种葱属植物对O2-·的清除能力

根据2.3进行操作，4种葱属植物对O2-·的清除率结果见图2。

图2 4种葱属植物醇提物的O2-·清除率Fig.2 The superoxide anion radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由图2可知，大蒜、洋葱、大葱、韭菜对O2-·的清除率在一定浓度范围内均随浓度增大而升高，存在明显的剂量-效应关系，其中4种葱属植物0.2 mL时的O2-·清除率约为1.0 mL时的50%。体积相同时，4种葱属植物的O2-·清除率大小顺序为：大蒜≈洋葱>大葱>韭菜，对O2-·的清除率均达到60%以上；其中大蒜和洋葱对O2-·的清除率相当，均超过90%，而具有显著的O2-·清除活性，而大葱和韭菜分别达到大蒜O2-·清除活性的80%和65%以上，也显示了较强的O2-·清除能力。

3.3 4种葱属植物对·OH的清除能力

根据2.4进行操作，4种葱属植物对·OH清除率结果见图3。

图3 4种葱属植物醇提物的·OH清除率Fig.3 The hydroxyl radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由图3可知，4种葱属植物对·OH均具有明显的清除能力，且随浓度增大而升高，存在一定的剂量-效应关系。体积相同时，4种葱属植物对·OH清除率大小顺序为：大蒜≥洋葱>大葱>韭菜。其中，不同体积的大蒜对·OH的清除能力均高于77%，在1.0 mL时达到99%；洋葱的·OH清除活性稍低于大蒜，在1.0 mL时也达到95%以上。相比而言，清除能力较弱的为大葱和韭菜，其对·OH的清除率分别为65%和50%。总的来说，大蒜和洋葱具有极强的OH·清除能力。

3.4 4种葱属植物总还原能力

根据2.5进行操作，4种葱属植物总还原能力结果见图4。

图4 4种葱属植物醇提物的总还原能力大小Fig.4 The total reducing capacities of ethanol extracts among four Allium species

由图4可知，4种葱属植物均具有一定的还原能力，且随浓度升高而增加，呈现剂量依赖性；总还原能力强弱顺序为：大蒜>洋葱>大葱≈韭菜。特别是大蒜醇提液的体积达到0.6 mL后其总还原能力显著上升，明显高于其他3种样品液；体积为1.0 mL时，大蒜的总还原能力约为洋葱的2倍、大葱和韭菜的3倍，显示了较强的还原能力，可能是由于溶液中含有其他氧化成分[13]；而大葱和韭菜的总还原能力在实验浓度范围内相当，相对大蒜较弱。

4 结论

采用4种体外抗氧化模型，考察和比较了大蒜、洋葱、大葱、韭菜的醇提液的抗氧化能力。结果显示：4种葱属植物均具有不同程度的体外抗氧化活性，并呈现一定的量效依赖关系。综合分析可知，大蒜、洋葱、大葱、韭菜的抗氧化活性强弱顺序为：大蒜>洋葱>大葱>韭菜。值得注意的是，大蒜在总还原能力方面显示了很强的优势，而洋葱在3种自由基的清除方面也表现出较强的能力，原因可能与其植物中所含的黄酮量稍高有关，并有待做进一步的研究。上述结果说明，大蒜和洋葱具有良好的体外抗氧化活性，具有深度开发利用价值。

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