基于超高效液相色谱-质谱的汉源花椒麻味物质构成研究

徐珊珊，张璐璐，高海燕，汪厚银，史波林，钟葵，赵镭*

(1.上海大学 生命科学学院，上海 200444；2.中国标准化研究院食品与农业标准化研究所， 北京 102200；3.浙江工商大学 食品与生物工程学院，杭州 310018)

1 概述

花椒是我国特色辛香料，主要产于四川、陕西、云南等省，其中四川汉源花椒以其色泽丹红、油重粒大、酥麻爽口、芳香浓郁而闻名于世，素有“川味花椒之王”的美称[1]。辛麻味是花椒主要风味物质和花椒重要品质的评价指标[2]。由于地域和气候影响，不同产地花椒麻感特征差异较大，直接影响花椒在市场上的价格和销售量。酰胺类物质是构成花椒辛麻味感的主要成分，花椒麻味感觉强度与其酰胺物质的总含量、构成和结构具有一定相关性。目前高精度分析花椒中酰胺类物质构成的研究较少，尤其是汉源花椒作为优质产区花椒与其他产地花椒相比，其酰胺类物质及主要麻味物质特征尚不明确[3-5]。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)具有检测快、灵敏度高和选择性强等优点[6]。本文在课题组前期研究基础之上，选取9个汉源花椒样品及麻味感觉强度(麻度)与汉源花椒相近或较高的我国5个花椒主产地样品，利用UPLC-MS/MS对样品中酰胺类物质及麻味物质进行定性定量分析，并结合聚类分析和主成分分析等将汉源花椒与其他产地花椒进行比较，得出汉源花椒的麻味物质构成特征。本研究对促进我国名优特产四川汉源花椒质量评价、产业发展和丰富汉源花椒品质基础数据库等方面具有重要参考意义。

2 材料与方法

2.1 仪器与材料

14个花椒供试样品：由四川川麻人家食品有限公司提供。样品均于2016年8月份采摘，自然晒干。其中，S1～S9号花椒样品均来自汉源花椒主产乡镇的不同村，每村5户标准采样，混匀后按四分法取样。其余S10～S14号花椒样品为其他主产区花椒种植基地定点采购，汉源花椒为南路(正路)花椒，其他产地花椒均为大红袍，花椒品种被鉴定为ZanthoxylumbungeanumMaxim.。样品产地信息见表1。

表1 花椒样品产地及编号Table 1 Places of origin and number of Zanthoxylum bungeanum samples

羟基-β-山椒素标准品：由西南交通大学、中国标准化研究院研制，并经中国食品药品检定研究院检验符合中药化学对照品的质量要求；无水乙醇：分析纯，河南荣腾食品添加剂有限公司；甲醇：色谱纯，Fisher实验器材(上海)有限公司；实验室用超纯水。

恒温水浴锅 品相科仪(上海)有限公司；PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司；Ultimate 3000超高效液相色谱仪、Hypersll Gold色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)、Q Exactive Focus液质联用仪 赛默飞世尔(中国)有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 供试品溶液制备

将花椒除杂去柄、籽、包籽等，进行粉碎，过20目筛网。称取15 g(精确到0.01 g)花椒粉，加无水乙醇75 mL，30 ℃条件下超声提取20 min，超声后，溶液全部倒入100 mL容量瓶中，无水乙醇定容至100 mL，摇匀后静置10 min，取上清液0.05 mL用甲醇稀释定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm有机系微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。每个样品3个平行样。

2.2.2 UPLC-MS色谱条件

色谱柱为Hypersll Gold(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相为甲醇(B)-水(A)，洗脱梯度见表2，检测波长为268 nm，柱温为30 ℃，流速为0.25 mL/min，分析时间为20 min，进样量为2 μL。每个样品测定3次，取平均值。

离子源：加热电喷雾电离源(HESI)，测定模式：Full MS和dd-MS2模式，正离子扫描；Full MS扫描范围：50～600，喷雾电压：3500 V；气化温度：320 ℃；鞘气(氮气)压力：40 psi；辅助气(氩气)压力：10 bar；毛细管温度：320 ℃。

2.2.3 花椒酰胺类物质的定性分析[7-13]

采用UPLC-MS法对样品中色谱峰进行定性分析。通过对样品总离子流图、提取离子流图及分子量在50～600之间的离子二级碎片信息进行分析，确定其化合物分子量，计算化合物组成等，并结合文献进一步推断，对色谱峰进行定性。

2.2.4 花椒酰胺类物质的定量分析

根据参考文献[14，15]中报道的半定量方法以羟基-β-山椒素标准品对花椒酰胺类物质进行半定量分析。

标准曲线的绘制：准确称量一系列羟基-β-山椒素标准品，采用甲醇配制成一系列质量浓度的溶液。以高效液相色谱峰面积为纵坐标，对应标品浓度为横坐标，得到标准曲线方程。为保证定量结果的可靠性，分别建立两条低、高含量的羟基-β-山椒素标准曲线，低含量标准曲线为：y=61764x+185.66，相关系数R2=0.9988，适用浓度范围为0.02～0.50 μg/mL；高含量标准曲线为：y=56668x+86333，相关系数R2=0.9999，适用浓度范围为5～200 μg/mL。

2.2.5 聚类分析[16,17]

为探究花椒样品中酰胺类物质种类的构成及含量之间的差异性，以样品中色谱峰面积为变量作为分类依据。将表1中14个产地中花椒酰胺类物质的峰面积数据导入SPSS 22.0，利用组间连接法，对14个产地花椒进行系统聚类分析。

2.2.6 主成分分析(PCA)[18,19]

PCA是将所提取的多指标信息通过数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，在坐标轴上通过投影将所有信息可视化的一种方法，最终将得到二维的PCA散点图，通过散点图可以直观地看出被分析数据之间的相互关系。PC1和PC2是散点图中的2个坐标轴，包含了在PCA转换中得到的第1主成分和第2主成分的贡献率，贡献率越大，说明主要成分越具有代表性。一般总贡献率超过70%～85%，此方法即可使用。通过PCA分析方法确定汉源花椒中特征麻味物质。

2.3 统计分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行系统聚类分析，采用Alphasoft 11.0进行主成分分析(PCA)。

3 结果与分析

3.1 花椒中酰胺类及麻味物质的定性分析

表3 花椒样品中酰胺类物定性和定量分析Table 3 Qualitative and quantitative analysis of amides in Zanthoxylum bungeanum samples

注：“-”代表未检出。

采用UPLC法得到14个花椒样品的叠加色谱图，见图1，各样品色谱峰分离度良好。

图1 14个花椒样品的UPLC叠加色谱图Fig.1 The UPLC chromatograms of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

利用高分辨质谱对花椒中各色谱峰进行定性分析，通过对样品总离子流图、提取离子流图及分子量在50～600之间的离子二级碎片信息进行分析，样品中各色谱峰由ESI(+)质谱图给出的[M+H]+离子及m/z，可确定离子为加氢离子，即得到化合物分子质量，通过高分辨质谱二级谱图信息，计算得出化合物组成、同位素分布等，结合文献[20，21]进一步推断各酰胺类物质可能的结构信息。由表3可知，14个样品中共得到25种具有酰胺结构的物质，结合文献数据分析得出其中包括12种麻味物质，分别为花椒油素、羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、α-山椒素、β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-花椒素、花椒素、异花椒素、γ-山椒素、四氢花椒素。25种酰胺类物质中，有10种化合物尚未鉴定。汉源9个不同产区的花椒样品中共有19种酰胺类物质，其中共有峰有18个；差异峰有1个，为二氢花椒素，仅在4个汉源花椒样品中出现。结果表明不同产区汉源花椒的酰胺类主要物质组成基本相同。其中，9个汉源花椒样品均含有除花椒油素、α-山椒素、β-山椒素之外的其他9种麻味物质，与赵志峰等在研究汉源干花椒油中麻味物质结果一致。其他产地花椒中，酰胺物质种类最多的是陕西韩城花椒，有15种酰胺类物质。此外，山东花椒样品有花椒油素，而其他花椒样品中均未检出。

通过与其他5个产地花椒比较发现，有4个色谱峰只在汉源花椒中出现，其中2个色谱峰为去氢-γ-山椒素和类二氢花椒素，其余化合物名称及有无麻味等信息目前未见报道，有待进一步结合酰胺类物质分离纯化、感官评价及NMR技术研究进行确定。

3.2 花椒中酰胺类及麻味物质的定量分析

通过低含量和高含量所对应的2条标准曲线对14个花椒样品的酰胺类及麻味物质进行定量分析，结果见表3。由表3可知，汉源花椒9个样品中酰胺类物质总含量在7431.97～10007.65 mg/100 g之间，平均含量为8723.75 mg/100 g，相对标准偏差(CV值)为15.3%；麻味物质含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之间，平均含量为8473.37 mg/100 g，其CV值为10.5%，表明不同产地的汉源花椒样品中酰胺类物质含量差异较小，具有较高相似度。全国其他5个产地花椒的酰胺类物质总含量在922.33～4280.02 mg/100 g之间，麻味物质含量在901.60～4189.97 mg/g之间。汉源花椒中平均酰胺类物质及麻味物质含量均高于其他5个产地花椒样品，表明汉源花椒作为优质产区花椒有其独特质量优势。

表3结果表明：麻味物质是花椒酰胺类物质的主要构成物质，占酰胺类物质总含量的97%左右。尽管汉源花椒与其他产地花椒在酰胺类物质和麻味物质的含量、组成上有差异，但14个样品中麻味物质含量占比没有显著差异。因此，对花椒样品中麻味物质组成差异进一步展开分析，结果见表4。

表4 花椒样品麻味特征物质组成分析Table 4 Composition analysis of pungent components in Zanthoxylum bungeanum samples %

注：“-”代表未检出。

汉源花椒的9种麻味物质组成中，5种为山椒素，4种为花椒素，其比例分别为97%和3%，呈现高山椒素、低花椒素的麻味物质构成特点。山椒素组成中以羟基-山椒素为主，特别是羟基-α-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-β-山椒素，其平均含量分别约占整体麻味物质含量的74%，18%和3.5%，4种羟基-山椒素含量约占麻味物质含量的96%。9个汉源花椒样品中各麻味物质组成及含量差异不显著，表明不同地区的汉源花椒样品呈现出相似的麻味物质构成。

其他5个产地花椒样品中，麻味物质构成特征也整体呈现高山椒素、低花椒素的特点。山东花椒样品特异性表现明显，其花椒油素含量较高，占比为21.2%，而其他花椒中未发现此类物质。青海花椒样品中仅含有羟基-山椒素，且羟基-α-山椒素占比(88.8%)显著高于其他产地样品。其余3个产地花椒样品中，羟基-山椒素占比约为98%，显著高于汉源花椒；而山椒素和花椒素含量均显著低于汉源花椒。

3.3 聚类分析

图2 14个产地花椒聚类分析图Fig.2 Clustering analysis of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

系统聚类可以根据样品之间的亲疏远近关系将四川汉源花椒与全国其他产地14个花椒样品进行聚类。由图2可知，14个花椒样品共聚为三类，其中汉源花椒样品19个色谱峰中有18个共有峰，化学成分基本相同，麻味物质含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之间，含量较高，聚为一类(1～9号样品)；河北、陕西、山西和山东花椒麻味物质含量在2586.98～4189.97 mg/100 g之间，属于中等含量，聚为一类(10，12～14号样品)。青海花椒样品中酰胺类物质种类最少，只有6种，麻味物质含量为901.60 mg/100 g，含量较低，其花椒质量明显区别于其他产地，因此单独聚为一类(11号样品)。

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析法(PCA)是一种常用的多元统计方法，利用降维思想，把具有一定相关性的多个影响因素转化为少数综合指标进行分析，找出样品间相关联的特征。选取14个样品中的12种麻味物质进行PCA分析，见图3。

图3 基于麻味物质含量的花椒样品主成分分析Fig.3 Principal component analysis of Zanthoxylum bungeanumsamples based on the content of pungent components

注：S为样品编号，F1为花椒油素，F3为羟基-ε-山椒素，F4为羟基-α-山椒素，F5为羟基-β-山椒素，F10为羟基-γ-山椒素，F12为α-山椒素，F13为羟基-γ-花椒素，F14为β-山椒素，F16为花椒素，F17为异花椒素，F21为γ-山椒素，F25为四氢花椒素。

第1主成分PC1的贡献率为98.46%，第2主成分PC2的贡献率为0.83%，总贡献率为99.29%，说明主成分具有代表性。通过PCA分析把14个花椒样品分为三类，即S1～S9号样品为一类，S11样品为一类，其余样品为一类，同聚类结果一致。图3中S表示样品编号，F表示色谱峰编号，色谱峰距离样品越近说明其相关性越高，以S8样品为汉源产地花椒聚类中心，分析色谱峰与汉源产地样品之间的关联性。以向量空间距离来看，色谱峰10为羟基-γ-山椒素，距离汉源样品最近，相关性较高。

4 讨论

羟基-山椒素(α，β，γ，ε)是花椒中的主要麻味成分，进行分析发现，本研究中的河北、陕西、山西、山东和青海花椒中的羟基-山椒素的构成特征为羟基-α-山椒素>羟基-β-山椒素>羟基-ε-山椒素>羟基-γ-山椒素，而汉源花椒中的羟基-山椒素的构成特征为羟基-α-山椒素>羟基-γ-山椒素>羟基-β-山椒素>羟基-ε-山椒素。与其他产地花椒体现不同的是，汉源花椒中羟基-γ-山椒素含量均大于其他5个产地的，是仅次于羟基-α-山椒素的第二大麻味物质，可以看出羟基-γ-山椒素是汉源花椒区别于其他5个产地花椒的主要麻味物质，与主成分分析结果相一致。Chen Huai-xuan等研究了汉源花椒与西南地区其他产地花椒的差异。汉源花椒中羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的比例为1∶1.5，青川、茂县、汶川和重庆产地花椒中的比例依次为19.2∶1，4.5∶1，6.9∶1和5.3∶1；汉源花椒中羟基-γ-山椒素的含量显著高于其他产地花椒，是区别于其他产地花椒的主要麻味物质，与本研究结果一致。通过与本研究中5个产地花椒及其他文献比较总结可得出，花椒的麻味物质构成特征整体表现为高羟基-山椒素、低花椒素特点，但不同产地和品种花椒的麻味物质构成模式不同，四川汉源高羟基-γ-山椒素含量是汉源花椒区别于其他产地花椒的最主要麻味特征。同时，汉源花椒中山椒素和花椒素含量也略高于全国其他产地花椒。

5 结论

本文利用超高效液相色谱结合高分辨率质谱(UPLC-MS)，主要探究我国四川汉源花椒中麻味物质构成种类及含量分析。通过高分辨质谱分析，确定14个样品中共有12种麻味物质，汉源花椒中有9种，分别为羟基-α-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-花椒素、γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、花椒素、异花椒素、四氢花椒素。通过定量分析发现，汉源花椒中羟基-α-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-ε-山椒素的平均含量占总酰胺平均含量的比例达到92.23%，得出汉源花椒麻味物质构成特征表现为高羟基-山椒素、低花椒素特点。与其他5个产地比较发现，汉源花椒中羟基-山椒素的构成特征为羟基-α-山椒素>羟基-γ-山椒素>羟基-β-山椒素>羟基-ε-山椒素，其中羟基-γ-山椒素含量约为14%，均大于其他5个产地，是仅次于羟基-α-山椒素的第二大麻味物质，可看出高羟基-γ-山椒素含量是汉源花椒区别于其他产地花椒的麻味特征。结合聚类分析及主成分分析发现，汉源花椒可以和全国其他产区样品进行明确区分。

花椒品质主要体现在麻味感觉强度及麻香两个方面，本文中利用UPLC-MS对汉源地区花椒进行定性定量分析，对完善我国名优特产汉源花椒的质量评价，打造特色产品品牌，促进汉源地方经济发展等方面具有重要参考意义，在后续研究中将结合感官评价、GCMS-O等手段进一步探究不同汉源产区的花椒麻度及麻香分类情况，从麻味物质构成、麻味感觉强度及麻香等多维度解析汉源花椒的品质特征，以进一步丰富汉源花椒品质基础数据库。

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