2015-2016年云南省疟疾实验室诊断质量及影响因素分析

， ，徐春，，

疟疾是由媒介按蚊传播的热带传染病之一。2015年全球共报告2.14亿疟疾病例，主要分布于非洲地区[1]。云南省自2010年启动消除疟疾项目以来，加大对疟疾的防控力度，疟疾病例转变为以非洲和东南亚国家为主要输入病例来源为主[2]。对疟疾病例的正确诊断是进行监测、治疗、媒介处置及开展病例溯源、病例确证等一系列防治工作的根本[3]。世界卫生组织在《消除疟疾现场手册》中对消除疟疾国家论证的11项主要内容中，也有5项内容涉及以诊断的正确性作为基础[4]。云南省疟疾诊断参比实验室(下文简称省参比实验室)作为首批通过国家疟疾诊断参比实验室认证的检测机构，自2012年开始对全省通过国家疾病监测信息管理系统上报的云南省疟疾病例(下文简称网报病例)进行确诊复核。本文就云南省参比实验室对2015-2016年网报疟疾病例的诊断质量进行评价，并对诊断影响因素进行分析。

1 材料与方法

1.1样本及相关信息收集 2015年和2016年通过国家疾病监测信息管理系统上报的云南省疟疾病例县(区)或州(市)疾病预防控制中心采集网报病例血样，填写个案调查表，制作疟疾血涂片和滤纸血膜样本，将血片和滤纸血膜样本及个案调查表统一送至省参比实验室。

病例确认实验方法 病例诊断准确性评价。由省参比实验室专业技术人员根据参考文献[4-7]采用双盲法分别对病例血样进行显微镜检法和nested-PCR法双人检测。同时对血片制作质量进行定量评价。

1.2 评价指标

1.2.1血样采集覆盖率及采样及时性指标 收样率=上报病例样本数/网报病例总数×100%,发病到诊断所需时间(就诊所需时间)=就诊时间-发病时间

1.2.2诊断正确性 疟原虫检测阳性符合率=省级符合阳性数/确诊病例总数×100%

疟原虫检测虫种符合率=省级虫种符合数/确诊病例总数×100%

以州市为单位，将报告单位分为卫生院、县医院、州医院、私立医院、县疾病预防控制中心(CDC)和市CDC，分别比较各州市和不同类型报告单位的采样及时性和诊断正确性。

1.3统计分析 用Excel 2010建立数据库，SPSS 19.0分别对率或均数的差异进行统计分析，检验水准0.05。

对影响云南省疟疾病例实验室诊断质量的因素进行分析，以各地区报告单位与省级疟原虫检测虫种符合率为应变量，就诊所需时间、报告单位类型和报告地区，采用Logistic逐步回归分析影响因素。

2 结 果

2.1血样采集及时性、样本上交覆盖性指标 除迪庆州外，全省15个州市在2015-2016年均有疟疾病例报告。血片送样共968张，滤纸血膜送样981份，总收样率为92.15%，其中2016年收样率为95.9%，较2015年收样率89.7%上升7%。此外，15个州市除西双版纳和昭通外，其余各州市2016年收样率均高于2015年；西双版纳和昭通2016年收样率较2015年分别下降58.7%和16.6%，见图1。

图1 2015-2016年不同地区收样率Fig.2 Samples collecting rate in different arears in 2015-2016

除迪庆州外，15个州市的网报疟疾病例在2015-2016年间发病到诊断所需平均时间为(5.1±6.6)d。其中网报疟疾病例数较多的州市，如德宏、保山和昆明，其网报疟疾病例从发病到就诊所需时间较其他州市要短；而玉溪、曲靖和怒江3个州市的网报病例从发病到确诊需时14 d以上。以报告单位分类，网报病例发病到乡镇卫生院就诊的时间最短，平均为(3.87±4.14)d，而到县区医院、州市医院和县区CDC就诊所需的时间则均比到乡镇卫生院长2～3倍，具有统计学意义。见图2。

图2 疟疾病例发病到就诊所需时间Fig.1 Time from onset to diagnosis spend by malaria patients

2.2 诊断正确性

2.2.1各地区阳性符合率和虫种符合率 2015-2016年，省参比实验室对各州市送检的所有疟疾血片和滤纸血膜均完成复核检测，其中显微镜检疟疾血片共968例，PCR复核病例981例。不同地区的诊断正确性结果详见表1。15个州市中，仅有昆明(χ2=58.06,P<0.05)和临沧(χ2=41.89,P<0.05)两地在2016年对病例的诊断阳性结果与省疟疾参比实验室镜检结果有差异，其他各地与疟疾诊断参比实验室的镜检或PCR检测阳性符合率均在95%以上；楚雄和文山则较2015年有所提高。

各州市对虫种的诊断与省参比实验室镜检或PCR的符合率均无差异，仅临沧的2016年诊断结果与省参比实验室PCR诊断相比，虫种符合率较2015较低(χ2=5.64,P<0.05)，其余州市诊断水平2016年与2015年基本持平，少数州市曲靖、楚雄和文山有轻微提升。而乡镇卫生院较其他报告单位对虫种的区分诊断较为准确。

结果提示，2015-2016年，全省各州市对疟疾诊断结果准确性基本持平，边境地区诊断水平总体较高。

2.2.22015-2016年疟疾分虫种诊断情况 2015、2016年共有10个州市报告未分型疟疾35例，未分型疟疾报告最多的州市为德宏(12例)、昆明(5例)和保山及普洱(皆为4例)，其余大理、红河、丽江、临沧、曲靖和文山共报告10例。省疟疾诊断参比实验室对2015年和2016年的疟疾网报送样病例同时进行镜检和PCR双重复核，结果显示除对三日疟和卵形疟二者的检出结果完全一致外，各级报告单位和省级采用不同方法的检出结果仍有一定差异性。对虫种区分的差异主要表现在省级实验室较各级报告单位更易检出恶性疟和间日疟的混合感染。

2.3血片制作质量 对云南省除迪庆州外的15各州市2015和2016年分别送检复核的完整疟疾血片629和316张进行血片制作质量评价。复检血片制作总分分别为78.55±8.47和80.34±9.44，2016年血片制作质量较2015年小幅提高。其中德宏州在2015年和2016年的制片平均总分分别为81.19±8.03和84.82±8.43，高于昆明、保山、临沧和大理等地。同时，德宏州两年的平均总分也高于昆明、保山、临沧、大理、版纳和普洱等地。结果提示发病率较高的边境地区血片质量制作水平总体高于其他地区。血片制作质量较低的地区主要体现在血片涂制时厚薄片布局不合理、厚片未溶血、厚片固定、涂片过厚或过薄、染色过深或过浅，部分地区血片厚血膜残缺。见表2。

表1 不同地区镜检与PCR检测结果符合统计表

Tab.1 Agreement between microscopy and PCR in different areas

地区检测样本数阳性符合率虫种符合率镜检PCR镜检PCR镜检PCR2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年德宏27722327922397.898.296.897.897.597.896.497.3昆明26232823100.078.3**88.978.369.260.955.656.5保山186871918797.896.696.896.696.296.695.795.4临沧2219221995.563.2**95.573.786.457.986.452.6**普洱6969100.0100.0100.0100.083.3100.083.3100.0版纳15319393.3100.084.2100.086.7100.078.9100.0大理125125100.0100.083.380.083.340.075.040.0丽江5151100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0怒江6161100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0红河2424100.0100.0100.0100.050.0100.050.0100.0昭通727285.7100.085.7100.057.150.057.150.0玉溪1212100.0100.0100.0100.0-100.0-100.0曲靖525280.0100.080.0100.060.0100.060.0100.0楚雄535360.0100.060.0100.060.0100.060.0100.0文山363666.7100.066.7100.066.783.366.783.3合计57839059139097.195.195.195.193.192.391.391.3

注：**与2015年比较P<0.05；地区黑体字体表示边境州市

表2 不同地区复检血片质量表

Tab.2 Quality of blood films in different locations

地区2015年2016年2015-2016年血片数总分血片数总分血片数总分德宏28181.19±8.0316584.82±8.4344682.53±8.36昆明2670.69±9.35**1675.94±5.6**4272.69±8.45**保山21977.1±8.01**8275.24±8.73**30176.59±8.24**临沧2775.74±8.93**1272.5±7.66**3974.74±8.6**普洱875±8.72978.11±6.771776.65±7.66**版纳1676.31±6.12574±8.222175.76±6.53**大理870.38±9.21**872.75±5.2**1671.56±7.33**丽江779±7.3281.5±3.54979.56±6.54怒江679.83±11.48177779.43±10.53红河378±1.73475.25±3.86776.43±3.26昭通776.86±4.91276.5±26.16976.78±10.18玉溪279.5±2.12178379±1.73曲靖1276.42±6.161821376.85±6.09楚雄578.6±9.4479.75±3.86979.11±7.08文山284±2.83477.75±6.95679.83±6.4合计62978.55±8.4731680.34±9.44**94579.15±8.84

注：**与德宏州比较，P<0.05； **与2015年比较，P<0.05；地区黑体字体表示边境地区。

2.4省级镜检和PCR检测方法的结果不一致分析 省级参比实验室同时采用镜检和PCR法对968例样本进行检测。其中两种方法结果不一致的样本有24份，占2.5%(24/968)。不一致性体现在，镜检为间日疟的16份样本，PCR检测为阴性，占66.7%(16/24)；镜检为阴性的8份样本，PCR检测为阳性，占33.3%(8/24)，其中恶性疟1例和间日疟6例，恶性疟和间日疟混合感染1例。

2.5疟疾病例实验室诊断质量的影响因素分析 将除迪庆以外的15个州市按是否位于边境进行划分，以乡镇卫生院为参考，对报告单位类型进行哑变量划分，对病例复核质量的影响因素进行logistic回归分析。自变量为报告单位与省级疟疾诊断参比实验室阳性结果的符合率，因变量为自发病到诊断所需时间、报告单位类型及报告地区。Logistic逐步回归分析结果显示发病到诊断所需天数、报告单位类型及报告地区是否位于边境地区都影响疟疾病例诊断的质量，详细结果见表3。

表3 疟疾病例诊断质量的logistic回归分析

Tab.3 Impact factors of malaria cases diagnosis quality by logistic regression

因变量回归系数标准误wald值P值OR值OR值95%置信区间诊断所需时间/d-0.0380.0147.4520.0060.9630.940～0.99报告单位类型12.8290.025 县区医院-0.5020.5920.7190.3960.6050.190～1.93 州市医院-1.2330.5515.0140.0250.2910.099～0.86 私立医院-0.5660.8290.4660.4950.5680.120～2.88 县区CDC-1.0500.5204.0760.0440.3500.130～0.97 州市CDC-1.9770.59611.0060.0010.1380.043～0.45地区是否边境-1.0270.3887.0000.0080.3580.170～0.77

3 讨 论

云南省是中国疟疾病例最多的省份，自2012年开始进行网报疟疾病例的复核工作。为持续掌握云南省疟疾病例诊断质量，本文对云南2015-2016年的疟疾网报病例诊断质量和采样覆盖率及及时性进行了分析评价。与董莹对2012-2014年云南省疟疾病例诊断质量评价结果相比，全省2015年和2016年的收样率分别为89.7%和95.9%，低于2014年的水平(96.3%)[5]。在诊断正确性上，2015-2016年各地对网报病例的诊断无论阳性结果或虫种区分皆高于2014年水平[5]，并高于我国四川省和广西宾阳县水平[8-9]。但与云南省2012-2014年的结果相比[5]，各地区2016年与省级PCR诊断虫种符合率为91.35%，略低于2014年水平；临沧市在定性和定种的正确性上表现不稳定，仍有波动，这一结果与董莹等的调查结果类似。全省对未分型病例的诊断减少18.6%，未分型病例报告最多的州市为德宏(12例)，红河州则较2012-2014年大幅下降了80%。

此外，省参比实验室采用显微镜检(χ2=7.67,P<0.05)和PCR(χ2=4.344,P<0.05)两种方法分别对疟疾病例进行的复核结果不一致性较2012—2014年上升4.9%和2.1%。省级实验室和各地区对相同样本分别采用传统镜检和nested-PCR法进行病例复核的结果存在一定差异，表现为nested-PCR法较传统镜检更易诊断阳性和区分虫种。传统镜检确认疟疾病原体是疟疾诊断的金标准，然而受制片质量、原虫密度、原虫特征等的影响，使传统镜检的敏感度较nested-PCR较低，即使富有经验的镜检专家，也容易导致检测结果敏感性和特异性的降低[10]，而nested-PCR经过多年应用改进，其敏感度和特异度可以达到98%以上[11]，尤其能够区别不同虫种的混合感染。其次，部分地区采用疟疾快速诊断法(RDTs)诊断疟疾，由于RDTs质量参差不齐，对疟疾和虫种区分的限制，加之由于富组氨酸蛋白基因的部分缺失[1]，使报告结果与复核结果存在差异。

Logistic回归分析提示，各地州对疟疾病例的诊断与省级PCR诊断虫种的符合性受发病到诊断所需天数、报告单位类型及报告地区是否为边境等因素影响。疟疾病例从发病到乡镇卫生院就诊的天数最短，与乡镇卫生院密集的卫生机构布点有关，得益于我国三级预防体系；就诊及时保证了适宜的采血时间，提高了检出率。同时，乡镇卫生院和各级疾病预防控制机构以及疟疾发病率较高的边境地区对疟疾诊断具有较高敏感性，比起其他医疗机构和其他地区也更容易准确诊断疟疾。

自2012年云南省开展网报病例复核工作以来，网报病例各项工作呈现稳步上升并维持在一个比较优良的健康水平。①由于定期开展对复核工作的评价，逐月向各州市反馈病例复核结果，并辅以点评，各地有目的的针对薄弱环节进行整改加强。②为达到2020年全面消除疟疾的目标，全省各州市重视疟疾检出水平的提高，增大镜检人员培训力度。③经过2012-2014年对疟疾病例复核流程、样本采集及质量控制体系的磨合适应，各州市整体依从性较好，但是仍有少数地区仍然需要加强疟疾综合防控能力的提高。特别是加强对非边境地区各级疾病防治人员的专业培训。对其他地区，尤其是已经通过消除疟疾考核的地区，应该继续加强并保持对疟疾防治能力的提高。④加强各地各级疾病防治和医疗单位检验人员对疟疾常见虫种恶性疟、间日疟和恶性疟混合间日疟感染的诊断鉴别。三日疟和卵形疟虽然不是云南省的主要疟疾种类，但在2014年的质量评价之后，通过利用省参比实验室疟疾镜检图像对各级疾病防控人员对其识别能力进行提高，检验人员谨慎认真，反而更易检出。而省级PCR诊断为间日疟、恶性疟或两者混合感染的病例，基层部门则较易诊断为阴性而漏诊。董莹等[5]调查发现，基因检测为间日疟感染(含混合感染)的血样以早、晚期滋养体为主，这在镜检鉴别上难度增加；加之非洲输入病例其间日疟早期滋养体寄生红细胞存在不显著胀大、且早期滋养体本身存在胞浆纤细等特征，经验不足镜检人员难以做出准确诊断。

总而言之，在消除疟疾阶段，应该研究探讨多种形式结合的培训、实践方式，持续提高并保持各地各级疾病防治部门的疟疾诊断能力。

(致谢：感谢云南省德宏、保山、昆明、普洱、临沧、大理、怒江、丽江、西双版纳、玉溪、楚雄、红河、昭通、迪庆、曲靖、文山16个州(市)级及其辖区各县疾病预防控制中心的大力支持。)

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