慢病毒介导的miR194-5p过表达精原细胞株的建立*

夏 静 夏蒙蒙 牛长敏 申雪沂 王建军 郑 英

扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室（江苏扬州 225001）

miRNA是一类长约18-22nt的小分子非编码RNA，它们能结合在多个下游靶基因的3′UTR（3’端非编码区），通常导致靶基因的表达沉默，进而在一系列生物学过程中发挥重要功能[1]。研究表明miRNA也参与精子发生过程的调控，且有表达细胞特异性及阶段性[2]。一些特异性的miRNA能作为诊断男性不育的潜在标记[3,4]。Stra8（stimulated by retinoic acid 8）对精子发生具有重要意义，其对减数分裂的启动是必须的，同时它对精原细胞的分化也发挥着重要的作用，但是其调控精子发生的机制尚不清楚。miRNA是否能通过Stra8调控精子发生过程尚不清楚。利用生物信息学分析方法，我们发现Stra8是miR-194-5p下游靶基因之一，因此我们试图探讨miR-194-5p与Stra8之间是否具有调控关系。本研究旨在构建携带miR-194-5p的慢病毒表达载体，并包装成慢病毒，以期达到高效稳定感染目的细胞Stra8-GC1-spg，建立稳定表达miR-194-5p的精原细胞株，为深入研究miR-194-5p与Stra8之间的调控关系及阐明Stra8在精子发生中的作用机制提供参考价值。

材料和方法

一、材料

慢病毒表达质粒pMSCV-PIG及Gag pol、VSV.G辅助质粒由江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室郁多男教授惠赠。LA tag酶、EcoRⅠ BglⅡ、miRNA逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司。pGEM-T-easy 载体、T4 DNA连接酶、切胶回收试剂盒购自Promega公司。293T细胞、Stra8-GC1-spg、大肠杆菌JM109由本实验室前期保存。DMEM、FBS购自Hyclone公司；X-gal和IPTG、嘌呤霉素、PEI购自北京索莱宝生物有限公司；核酸提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；引物合成及DNA测序由深圳华大基因生物工程公司完成。

二、方法

（一）目的片段的扩增

利用小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR扩增引物：F：5′-GGAGATCTCCACCA CACACCAGGAAGAG-3′，R: 5′-GGGAATTCT AACCAAGAGCCCACCCAG-3′；PCR反应体系：ddH2O 31.5µL，LA buffer 5µL，2.5mMdNTPs 8µL，F(10µM)2µL，R（10µM）2µL，LA tag酶0.5µL，DNA 1µL；PCR反应条件：95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环，72℃ 5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

（二）pGEM-T-easy-miR194-5p重组质粒的构建

PCR产物经AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，后与pGEM-T-easy 载体连接，连接产物转化到JM109感受态中，涂于LB琼脂糖平板（含50μg /μL X-gal和0.1moL IPTG、50μg /mL氨苄青霉素）上。37℃孵育过夜，经蓝白斑筛选，取白色克隆,摇菌过夜，碱裂解法提取质粒，EcoRⅠ酶切鉴定，最后进行DNA序列测定验证。

（三）pMSCV-PIG-miR194-5p重组载体构建

将pGEM-T-easy-miR194-5p及慢病毒载体pMSCV-PIG分别进行EcoRⅠ、BglⅡ双酶切，回收并纯化所需片段，以载体插入片段=1:3～1:5摩尔比进行连接，转化JM109感受态菌后涂于LB琼脂糖平板（含50μg /mL氨苄青霉素）上，37℃过夜。次日，挑单菌落接种于LB培养液（50μg /mL氨苄青霉素）中，37℃振摇培养过夜,用碱裂解法提取质粒，利用EcoRⅠ、BglⅡ双酶切鉴定。

（四）慢病毒包装

将293T细胞铺于6cm细胞培养皿内，使次日细胞融合率为60%左右。每孔加3mL DMEM完全培养基。慢病毒包装转染体系：0.9%NaCl 500μL、Gag pol 3µg 、VSV.G 3μg、pMSCV-PIG-miR194-5p 8μg（实验组）或pMSCV-PIG 8μg（对照组）、PEI 100μL（μg/μL），混匀后室温孵育10min，加至培养的293T细胞中，37℃、5%CO2过夜，12h后更换为DMEM完全培养基。分别收集转染后36h、48h、60h、72h的病毒上清，经0.45μm滤器过滤，-80℃保存。

（五）慢病毒感染效果的验证

将293T细胞铺于6cm细胞培养皿内，使次日细胞融合率为60%左右。按照以下体系感染293T细胞：慢病毒上清 2mL、enhance 液1mL、polybrene 1.5μL，37℃、5%CO2培养箱培养。6h后进行重复感染一次。6h后再进行第三次感染。6h后更换为新鲜的DMEM完全培养基。72h后用倒置荧光显微镜观察感染的293T细胞有无绿色荧光。分别提取pMSCV-PIG-miR194-5p感染组及 pMSCV-PIG对照组293T细胞总RNA，利用逆转录试剂盒反转录为cDNA，qRTPCR验证感染慢病毒的293T细胞内的miR194-5p转录水平。

（六）稳定过表达miR194-5p Stra8-GC1-spg细胞株的建立

将Stra8-GC1-spg细胞铺于六孔板内，使次日细胞融合率为50%左右。在六孔板每孔内加入enhance液0.5mL、慢病毒上清1.5mL 、polybrene1μL。37℃、5%CO2培养箱培养。6h后进行重复感染一次。6h后再进行第三次感染。6h后更换为新鲜的DMEM完全培养基。72h后用倒置荧光显微镜观察细胞是否带有绿色荧光。用5μg/mL嘌呤霉素筛选一周，以获得稳定过表达miR194-5p Stra8-GC1-spg细胞株。

（七）miR194-5p表达水平的验证

分别取感染慢病毒pMSCV-PIG-miR194-5p及对照组pMSCV-PIG的Stra8GC1细胞，用TRIzol提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书步骤进行反转录，以此cDNA为模板，应用实时定量PCR法检测miR194-5p的表达水平，并用2-ΔΔct计算其相对表达量，两组间数据比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

结 果

一、目的基因片段pri-miR194-5p的扩增

以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增，获得目的基因片段pri-miR194-5p，其大小为293bp，与预计片段大小相一致（图1）。

图1 pri-miR194-5p PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

二、pri-miR194-5p与pGEM-T-easy 载体的连接

将pri-miR194-5p PCR产物与pGEM-T-easy载体相连接，经酶切鉴定证实PCR片段已成功插入到pGEMT-easy载体（图2）。DNA序列测定证实此序列与pri-miR194-5p序列完全一致。表明pGEM-T-easy-primiR194-5p重组载体构建成功。

三、pMSCV-PIG-miR194-5p重组载体的构建

将重组质粒pGEM-T-easy-pri-miR194-5p及空载慢病毒载体pMSCV-PIG分别进行双酶切,然后进行连接，获得的重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p经限制性内切酶酶切鉴定,发现重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p构建成功（图3）。

四、慢病毒的包装及表达的验证

图2 pGEM-T-easy-pri-miR194-5p酶切鉴定产物琼脂糖凝胶电泳图

图3 pMSCV-PIG-miR194-5p酶切鉴定

图4 pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p重组质粒转染293T细胞72h后荧光图

图5 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染293T细胞72h后荧光图

应用PEI法转染293T包装细胞，72h后荧光显微镜观察发现大多数293T细胞均显示绿色荧光（图4）。用慢病毒上清感染293T细胞，72h后荧光显微镜观察，发现大部分293T细胞显示绿色荧光（图5）。表明包装的慢病毒颗粒能成功感染细胞。应用实时定量PCR对感染后的293T细胞进行miR194-5p表达水平检测，结果发现，与对照组相比较，实验组细胞表达高水平miR194-5p（图6）。提示慢病毒能有效感染293T细胞并高表达miR194-5p。

五、过表达miR194-5p Stra8-GC1-spg细胞株的建立

应用慢病毒上清感染Stra8-GC1-spg。72h后荧光显微镜观察，发现细胞有绿色荧光产生（图7）。经嘌呤霉素筛选1周后，对miR194-5p表达水平进行定量分析。结果发现与对照组相比较，实验组Stra8-GC1-spg细胞中miR194-5p的表达量明显增高（图8），表明成功稳定过表达miR194-5p Stra8-GC1-spg细胞株。

图6 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的293T细胞中miR194-5p相对表达水平分析

图7 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染Stra8-GC1-spg细胞72h后荧光图

图8 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的Stra8-GC1-spg细胞中miR194-5p的相对表达水平分析

讨 论

精子发生是高度精密的过程，此期间需要大量的基因在转录、转录后及表观遗传学水平对其进行调控。大量研究发现在精子发生的不同阶段，miRNAs作为转录后调控元件，可能通过激活特异性基因的表达参与精子发生[5]。在人类精子发生中，miRNAs也发挥着重要的功能[6,7]。 研究发现在小鼠精子发生中一些miRNAs（miR-221, miR-203, miR-34b-5p）特异性表达于精原干细胞、减数分裂前细胞及减数分裂细胞中[8]。 miR-34c特异性表达在睾丸内，且主要表达在减数分裂晚期的粗线期精母细胞及精子细胞中[9]。 miR-449a 及miR-34b/c在鼠科精子发生中有协同作用[10]。miR-146能作用在靶基因Med1上进而阻碍视磺酸诱导精原细胞分化[11]。 另外，miR-221/222家族通过作用在Kit mRNA 上，进而维持未分化精原细胞数量[12]。

目前已知Stra8作为精子发生中一个基因，对精原细胞的分裂分化及减数分裂的启动都发挥着重要的作用。研究发现Stra8基因敲除的雄性小鼠不育[13]。但是关于Stra8在精子发生中的作用机制目前仍未能完全阐明。Yu等发现miR-34c可能通过作用在Nanos2的3’UTR上抑制其表达，而这将导致Stra8 、Scp3及 Dazl的表达上调，而促进减数分裂进程[14]。Wang等发现在鸡的睾丸内miR-31 可以通过作用在靶基因Stra8的3’UTR（非编码区）上直接抑制Stra8的表达进而阻滞减数分裂的进程[15]。而有关miRNAs与Stra8之间的关系目前仍未完全阐明。信息学分析发现mmu-miR-194-5p是Stra8上游的靶向miRNA。而目前有关miR-194-5p的研究仅仅是着重在它在各种肿瘤及免疫性疾病上的作用[16-19]。而有关miR-194-5p与Stra8之间的调控关系及它们在精子发生中的作用目前仍未有任何报道。是否有可能miR-194-5p可以在精子发生的特定阶段被激活，从而发挥对Stra8的调控作用呢？因此研究miR-194-5p与Stra8之间的关系对揭示Stra8在精子发生中的作用机制具有十分重要的意义。

本实验室前期工作中已构建了Stra8过表达精原细胞株，将其命名为Stra8-GC1-spg。为了进一步研究miR194-5p与Stra8之间的调控关系，本研究采用了慢病毒重组质粒pMSCV-PIG-miR194-5p来包装293T细胞，产生慢病毒颗粒。为了检测该慢病毒是否包装成功，我们将获得的病毒上清首先感染了293T细胞，通过荧光实时定量发现与对照组相比，pMSCV-PIG-miR194-5p慢病毒感染组，miR194-5p表达水平明显增高。说明该慢病毒已经包装成功。本实验中所用的pMSCV-PIG空载质粒带有GFP标签，能使细胞产生绿色荧光。转染293T时使用的PEI(Polyethylenimine)是一种聚合物转染试剂，它是运用最广泛及最有效的非病毒载体之一[20]。PEI每相隔二个碳原子就有1个氨基，构成了多聚网状结构，它具有大量的正电荷，能使 DNA 缩合成颗粒状。PEI/DNA 复合物通过静电作用吸附到细胞表面，经过细胞内吞作用进入细胞内[21]。PEI 几乎可在任何 pH 条件下都能够吸收质子，这使其具有质子海绵的作用[22]。这一特性使 PEI能在内涵体的酸性环境中吸收 H+，进而增高内涵体内的渗透压，导致膜不稳定甚至破裂，从而使PEI/DNA复合物从内涵体内逃逸出来，避免 DNA 降解。一般认为，PEI 的基因转染效率随其相对分子质量的增大而提高。这是由于 PEI 相对分子质量越大，其质子海绵作用越强，PEI/DNA 复合物就更快的被释放入胞质，从而减少了内涵体对 DNA 的降解，进而提高了转染效率[23]。重要的是PEI以盐酸盐形式提供，大大提高了水溶性。与Lipofectamine 2000相比，PEI转染效率更高，且细胞凋亡率更低[24]。我们用该慢病毒感染Stra8-GC1-spg细胞72h后，嘌呤霉素筛选获得稳定表达miR194-5p的Stra8-GC1-spg细胞株。通过荧光实时定量分析发现miR194-5p 在Stra8-GC1-spg细胞中miR194-5p的表达水平与对照组相比显著性增高。当我们应用瞬时转染法转染精原细胞株时转染效率很低，但用此方法包装出的慢病毒感染Stra8-GC1-spg细胞使感染效率大大提高，因而更加有利于后续实验的开展。本研究采用的慢病毒系统优于一般的商品化的慢病毒感染系统，既具有GFP荧光示踪系统，又能够通过嘌呤霉素进行阳性细胞的筛选。

总之，本实验成功构建了过表达miR194-5p 的Stra8-GC1-spg细胞株。这种细胞系可以作为一种细胞模型用于后续研究miR194-5p与Stra8之间的调控关系，为进一步揭示Stra8在精子发生中的作用机制奠定基础。

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